傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化及其臨床意義

李慧，劉晶，楊金英

1.西北婦女兒童醫(yī)院兒童血液腫瘤科，陜西 西安 710003；

2.寶雞市婦幼保健院兒童感染科，陜西 寶雞 721000；

3.西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)新生兒科，陜西 西安 710000

傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)是一種由EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染所致的急性傳染性疾病，頸部淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱以及咽喉疼痛為IM 疾病典型臨床表現(xiàn)。此外，患者還伴有外周血異型淋巴細(xì)胞水平上升以及肝臟脾臟腫大等相關(guān)表現(xiàn)[1-2]。IM好發(fā)于兒童群體，患兒感染后癥狀隱秘，未見明顯臨床表現(xiàn)，診斷存在難度，雖然IM為自限性疾病，大部分患兒預(yù)后良好，但是依然有少量患兒會(huì)出現(xiàn)嗜血細(xì)胞增多癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，預(yù)后情況不佳[3]。目前尚未完全明確IM發(fā)病具體機(jī)制，但是已經(jīng)了解到其發(fā)生與機(jī)體免疫功能紊亂關(guān)系密切[4-5]。因此探究IM 發(fā)生及病情進(jìn)展與免疫功能之間關(guān)系不僅有利于分析IM 具體發(fā)病機(jī)制，還對(duì)患兒其后病情診斷以及治療具有積極意義。本研究分析IM 患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平變化及其在患兒病情發(fā)生進(jìn)展中作用，以深入了解IM 免疫功能異常狀態(tài)，為后期患兒病情評(píng)估及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018—2020 年寶雞市婦幼保健院收治的105例IM患兒作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)IM 參照對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)[6]確診；(2)患者病情由臨床表現(xiàn)、血清學(xué)病毒抗體以及外周血涂片實(shí)驗(yàn)等證實(shí)；(3)入組前尚未行任何對(duì)癥治療；(4)年齡1～13歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在重要器官如消化道、心臟、肝臟等功能異常者；(2)入組前應(yīng)用免疫抑制劑或者糖皮質(zhì)激素治療者；(3)存在其他感染或者并發(fā)惡性腫瘤者；(4)并發(fā)先天性免疫異常疾病或者免疫功能障礙者。選取同期在醫(yī)院體檢的健康兒童100 例作為對(duì)照組。對(duì)照組兒童各項(xiàng)相關(guān)檢查均正常，無其他疾病。研究組中男性56 例，女性49 例；年齡1～13 歲，平均(6.24±1.53)歲。對(duì)照組中男性51 例，女性49 例；年齡1～13 歲，平均(6.58±1.76)歲。兩組兒童的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，所有兒童監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 外周血T淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定相應(yīng)試劑以及抗體均采購自美國BD公司。研究組患兒在治療前，對(duì)照組在體檢當(dāng)日收集空腹靜脈血2 mL保存于肝素抗凝管中，加入等量磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)后進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分離。將分離獲得的50 μL PBMC加入10 μL CD3-PE-Cy5、10 μL CD4-PE、10 μL CD8-FITC，以渦旋方式混勻后在室溫環(huán)境下進(jìn)行15 min避光孵育，孵育結(jié)束后進(jìn)行離心洗滌，將上清液棄去后加入300 μL PBS，12 h 內(nèi)上機(jī)測(cè)定。其他分離獲得PBMC中加入佛波酯、離子霉素以及莫能霉素，置于37℃及5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4～6 h，隨后再次進(jìn)行離心洗滌，收集100 μL 刺激培養(yǎng)細(xì)胞添加IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PE-Cy5 各20 μL 作為同型對(duì)照，渦旋混勻后在室溫環(huán)境下進(jìn)行15 min 避光孵育。另收集100 μL刺激培養(yǎng)細(xì)胞添加20 μL CD3-PE-Cy5與20 μL CD8-FITC 為待測(cè)樣品管，渦旋混勻后避光孵育以進(jìn)行細(xì)胞膜表面標(biāo)記，離心、洗滌、重懸后加入100 μL固定劑進(jìn)行15 min 室溫避光孵育，離心、洗滌、棄去上清液后緩慢混勻，加入100 μm破膜劑，室溫環(huán)境下避光孵育5 min后離心洗滌。待測(cè)樣品管細(xì)胞均分為兩管，分別向其中加入10 μL白介素-4-PE與干擾素-γ-PE，渦旋均勻后避光孵育處理15 min以使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，離心洗滌后將上清液棄去，隨后在試管內(nèi)加入PBS 300 μL 進(jìn)行細(xì)胞重懸，上機(jī)測(cè)定CD8+、CD4+、CD3+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+值。

1.2.2 患兒病程及病情嚴(yán)重程度評(píng)估 入院后依據(jù)病程將患兒分為急性期組與恢復(fù)期組，其中急性期為首次發(fā)病7 d 時(shí)間內(nèi)，恢復(fù)期為初次發(fā)病至接受治療后25～30 d[7]。依據(jù)IM所致系統(tǒng)損傷將患者分為輕癥組與重癥組，其中輕癥為IM發(fā)生伴最多1個(gè)系統(tǒng)損傷，重癥為IM發(fā)生伴最少兩個(gè)系統(tǒng)損傷[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料表示為例，差異比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析T 淋巴細(xì)胞亞群對(duì)IM 的診斷價(jià)值，應(yīng)用Spearman 相關(guān)性分析外周血T 淋巴細(xì)胞亞群與病程、病情嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童的外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 研究組兒童的CD8+、CD3+明顯高于對(duì)照組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組兒童的外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

表1 兩組兒童的外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù)105 100 CD8+(%)40.33±7.26 21.59±6.28 19.724 0.001 CD4+(%)20.53±5.19 35.94±6.57 18.682 0.001 CD3+(%)78.29±7.54 62.94±8.14 14.015 0.001 CD4+/CD8+0.63±0.19 1.34±0.43 15.414 0.001

2.2 T 淋巴細(xì)胞亞群對(duì)IM的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示，CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+用于IM診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.850、0.848、0.810、0.771，見表2和圖1。

圖1 T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)IM診斷價(jià)值的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of the diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

表2 T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)IM的診斷價(jià)值Table 2 Diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

2.3 不同病程患兒的T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較 依據(jù)病程進(jìn)行分組，105 例患兒中急性期與恢復(fù)期分別68 例與37 例，急性期組兒童的CD8+、CD3+明顯高于恢復(fù)期組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于恢復(fù)期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同病程患兒的T淋巴細(xì)胞亞群水平比較±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

表3 不同病程患兒的T淋巴細(xì)胞亞群水平比較±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

組別急性期組恢復(fù)期組t值P值例數(shù)68 37 CD8+(%)44.23±5.79 33.16±2.89 10.896 0.001 CD4+(%)18.19±3.22 24.83±5.40 7.898 0.001 CD3+(%)80.55±7.22 74.14±6.31 4.539 0.001 CD4+/CD8+0.59±0.17 0.70±0.20 3.038 0.003

2.4 不同病情嚴(yán)重程度患兒的T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較 依據(jù)患兒病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分組，105 例患兒中輕癥與重癥患兒分別43 例與62 例，重癥組兒童的CD8+、CD3+明顯高于輕癥組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于輕癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同病情嚴(yán)重程度患兒的T淋巴細(xì)胞亞群水平比較(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

表4 不同病情嚴(yán)重程度患兒的T淋巴細(xì)胞亞群水平比較(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

組別輕癥組重癥組t值P值例數(shù)43 62 CD8+(%)33.94±5.29 44.76±4.67 11.050 0.001 CD4+(%)23.96±5.14 18.15±3.70 6.736 0.001 CD3+(%)74.22±3.64 81.11±8.25 5.132 0.001 CD4+/CD8+0.73±0.18 0.56±0.17 4.979 0.001

2.5 外周血T淋巴細(xì)胞亞群與病程、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血CD8+、CD3+水平與病程呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平與病程呈正相關(guān)(P＜0.05)；外周血CD8+、CD3+水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表5。

表5 外周血T淋巴細(xì)胞亞群與病程、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性Table 5 Correlation analysis between peripheral blood T lymphocyte subsets and course of disease and disease severity

3 討論

IM為EBV侵入導(dǎo)致全身免疫功能損傷傳染類疾病，B淋巴細(xì)胞表面存在EBV受體，EBV在人體與對(duì)應(yīng)受體結(jié)合后可以促進(jìn)含有核抗原B淋巴細(xì)胞增殖，誘使淋巴細(xì)胞出現(xiàn)異型，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答以及增殖過程，最終導(dǎo)致IM發(fā)生以及患者病情進(jìn)展[9-10]。研究顯示IM 發(fā)生為繼發(fā)惡性組織細(xì)胞增生癥以及淋巴細(xì)胞白血病重要危險(xiǎn)因素，其也是兒童惡性腫瘤發(fā)生重要原因之一，IM患兒免疫功能缺乏以及不足是患者預(yù)后不佳重要原因之一，因此及時(shí)評(píng)估IM 患兒免疫功能是避免病情進(jìn)一步惡化，改善患兒預(yù)后關(guān)鍵[11]。

本研究結(jié)果顯示，IM組兒童CD8+、CD3+明顯高于對(duì)照組，CD4+、CD4+/CD8+顯著低于對(duì)照組，表明IM患兒T細(xì)胞會(huì)因?yàn)镠BV感染而被激活，導(dǎo)致T細(xì)胞不斷增殖，使細(xì)胞毒T 細(xì)胞以及抑制T 細(xì)胞水平增加。陳若紅等[12]研究認(rèn)為相對(duì)于健康兒童，IM 組兒童CD8+水平較高，CD4+、CD4+/CD8+水平較低，該研究認(rèn)為IM患兒體內(nèi)細(xì)胞免疫功能損傷，同時(shí)免疫調(diào)節(jié)功能異常，機(jī)體對(duì)于病毒防御能力減弱，最終導(dǎo)致IM 發(fā)生。另一項(xiàng)研究中也顯示IM 患兒CD3+、CD8+水平較健康者高，CD4+、CD4+/CD8+水平較健康者低，細(xì)胞免疫在EBV 感染中發(fā)揮重要作用，IM 患兒細(xì)胞免疫功能異常，測(cè)定其水平可以為IM診斷提供重要依據(jù)[13]。本研究為進(jìn)一步明確T 淋巴細(xì)胞亞群在IM 患者病情評(píng)估中作用，將CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+水平應(yīng)用于IM患兒病情診斷中，ROC曲線顯示各指標(biāo)用于IM 診斷AUC 分別為0.850、0.848、0.810、0.771，顯示T 淋巴細(xì)胞亞群水平測(cè)定在IM 病情評(píng)估中有一定價(jià)值，間接證實(shí)其在IM發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

本研究中急性期組兒童CD8+、CD3+顯著高于恢復(fù)期組，CD4+、CD4+/CD8+顯著低于恢復(fù)期組，表明T淋巴細(xì)胞亞群水平與患者病程關(guān)系密切，分析認(rèn)為急性期CD8+、CD3+水平上調(diào)，CD4+水平下調(diào)，顯示免疫促進(jìn)作用增強(qiáng)，免疫抑制作用減輕，這一變化有助于促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)EBV裂解循環(huán)蛋白作用，進(jìn)而使EBV特異性CD8+細(xì)胞大量增殖，幫助殺滅已感染EBV B 細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體對(duì)于病毒清除作用[14-15]。另有研究顯示，相對(duì)于健康者，IM 急性期CD4+、CD19+、CD16+56+降低，恢復(fù)期CD4+、CD19+、CD16+56+上升，分析認(rèn)為患兒CD4+可以促進(jìn)功能性細(xì)胞因子形成，抑制EBV 感染B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，而CD8+細(xì)胞則可以有效識(shí)別EBV 裂解期抗原，促進(jìn)機(jī)體對(duì)于EBV 陽性B 細(xì)胞殺傷作用[16]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示外周血CD8+、CD3+水平與病情嚴(yán)重程度正相關(guān)(r=0.494、0.614)，CD4+、CD4+/CD8+水平與與病情嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)(r=-0.319、-0.747)，顯示不同病情嚴(yán)重程度患兒T淋巴細(xì)胞亞群水平不同。另有研究顯示痰熱熾盛型IM患兒在應(yīng)用更昔洛韋聯(lián)合蒲地藍(lán)口服液進(jìn)行治療，治療后患者病情減輕，CD8+、CD3+水平下降，CD4+、CD4+/CD8+水平上升，也顯示T 淋巴細(xì)胞亞群水平與患者病情關(guān)系密切[17]。相對(duì)于無肝損傷IM 患兒，IM肝損傷患兒體內(nèi)CD8+毒性作用以及細(xì)胞殺傷能力未見增強(qiáng)，但是CD8+數(shù)目顯著增加，也顯示CD8+水平變化可能與IM患兒病情進(jìn)展[18]。

綜上所述，IM 患兒體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞亞群水平異常，提示患兒免疫功能異常，且這種異常與IM 發(fā)生、病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切，可為患兒臨床診斷、治療提供相關(guān)理論依據(jù)。