長鏈非編碼RNA NORAD在肺癌中的表達及其對肺癌細胞增殖能力的影響

王靖，楊利杰，宋政，王瑞宇，張鈺璐，李俊

1.大理大學臨床醫(yī)學院，云南 大理 671000；

2.大理大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，云南 大理 671000；

3.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671000

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)主要包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)和微小RNA(miRNAs)。LncRNAs是一種長度超過200個核苷酸的ncRNA，主要位于細胞核或者細胞質(zhì)中[1]，其表達與細胞生長、發(fā)育、腫瘤發(fā)生及進展等多種細胞生物學過程關系密切[2]。LncRNAs可通過競爭內(nèi)源性RNA(ceRNAs)的方式，作為miRNA“分子海綿”來抑制miRNA 介導的靶標mRNA 的降解[3-4]。例如，LncRNA LCAT1 可作為ceRNA，通過“海綿化”miR-4715-5p 上調(diào)Ras 相關C3 肉毒菌素物底物1(ras-related C3 botulinum toxin，Rac1)活性，進而促進肺癌的進展[5]。LncRNA DRAIC在肺癌中的表達顯著升高，與患者的預后密切相關，其可通過抑制miR-223-3p的表達，促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲[6]。LncRNA可作為肺癌的診斷標志物及候選治療靶點[7]。

LncRNA DNA損傷誘導的非編碼RNA(NORAD)也稱為LINC00657，位于chr20:34636726-34636747，主要存在于細胞質(zhì)中，在多種腫瘤的表達均顯著升高[8]。NORAD 可通過miRNA-455/CDK14 軸影響肺癌細胞的增殖能力[8]。但NORAD 與肺癌細胞增殖的深入調(diào)控機制，尚不明確。課題組前期通過高通量測序篩選發(fā)現(xiàn)，包括LncRNA NORAD 在內(nèi)的多種LncRNA 的表達顯著上調(diào)[9]。本研究在前期研究的基礎之上，研究NORAD 在肺癌中的表達及其與細胞增殖的關系，初步明確NORAD在肺癌中的可能調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 肺癌細胞(A549、HCC827、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1650)購自于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司，HFL1(人胚肺成纖維細胞)購自于武漢靈思生物技術有限公司，由本實驗室保存。Annexin V FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8 試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司，免疫熒光檢測試劑盒購自于武漢靈思生物有限公司，qRT-PCR 檢測試劑盒購自于美國Bio-Rad 公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自于美國Invitrogen公 司，Anti-Bad antibody、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-Cleaved Caspase-3 antibody、Anti-Ki-67 antibody 購自于英國Abcam 公司；Anti-GAPDH antibody 購自于武漢三鷹生物技術有限公司。hsa-miR-26b-5p mimics、hsa-miR-654-5p mimics、及NC (Negative control)購自于廣州銳博生物，si-NORAD (5'-AAGCCACCUUUGTGAACAGUA-3')購自于上海吉瑪制藥技術有限公司。qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。10 對肺癌患者腫瘤及配對的癌旁組織均為2019 年1月至2021 年12 月在我院心胸外科住院，行肺手術后經(jīng)病理檢查明確診斷為肺癌患者?；颊吣挲g44～76 歲，平均年齡55 歲，其中男性4 例，女性6 例。腫瘤及其配對的癌旁樣本置于液氮中保存。每例患者均已簽署知情同意書，由我院倫理委員會審查和批準。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers of qRT-PCR

1.2 主要儀器 HERAcell 150i1型CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo 公司；Lightcycler480 型qRT-PCR 儀購自于美國Roche公司；NIKON DS-U3正置熒光顯微鏡購自于日本尼康；Multiskan Sky 全波長酶標儀購自于美國Thermo公司；FACS Calibur 流式細胞儀購自于美國BD 公司；PowerPace Basic 型電泳儀購自于美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺癌組織樣本RNA-seq分析 取6個肺癌組織及配對的癌旁組織樣本經(jīng)過RNA 抽提、純化、建庫之后，基于Illumina HiSeq2500 測序平臺，對這些文庫進行雙末端(paired-end，PE)測序，篩選差異表達基因(篩選標準：|log2FoldChange|＞1，P＜0.05)。

1.3.2 NORAD互做miRNA生物信息學分析 利用在線分析軟件Starbase (https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、Jefferson (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)、miRDB (http://mirdb.org/)及miRNA 測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析NORAD可能互做miRNA。

1.3.3 細胞復蘇及培養(yǎng) 細胞復蘇后，A549 及HFL1 細胞利用Ham's F-12K 加10% 胎牛血清培養(yǎng)，HCC827、NCI-H1299、NCI-H1395 及NCI-H1650 細胞利用RPMI-1640 加10%胎牛血清培養(yǎng)；另所有細胞培養(yǎng)基中均增加1%青霉素-鏈霉素雙抗培養(yǎng)。所有細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞聯(lián)合度達到80%～90%時，按照1∶(2～3)的比例傳代，備用。

1.3.4 qRT-PCR檢測NORAD及hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p表達 TRIzol裂解法提取肺癌組織及細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測NORAD、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p 的表達。數(shù)據(jù)以2-△△CT表示，△CT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct 值，△△CT=實驗組[Ct (目的基因)-Ct (內(nèi)參基因)]-對照組[Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)]。

1.3.5 免疫熒光檢測肺癌組織中Ki-67表達 肺癌及配對的癌旁組織樣本經(jīng)冰凍切片，室溫晾干水分，4%多聚甲醛固定10 min，置于磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min?？乖迯秃?，5%BSA 抗原阻斷，滴加Ki-67 抗體(1∶300)，4℃孵育過夜；PBS 清洗3 次，每次5 min，滴加Cy3標記的二抗，37℃孵育60 min，PBS清洗3次，每次3 min，滴加抗熒光淬滅封片劑。利用日本尼康正置熒光顯微鏡(NIKON DS-U3)采集照片。利用Image-pro plus6.0 分析軟件計算每個樣本中Ki-67 的平均熒光值。

1.3.6 細胞分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的A549細胞，1×104cells/mL的細胞量傳于細胞培養(yǎng)6孔板，將A549 細胞隨機分為空白對照組(Control)、si-NORAD組、miR-654-5p mimics 組、miR-26b-5p mimics 組、si-NORAD與miR-654-5p mimics聯(lián)合組、si-NORAD與miR-26b-5p mimics 聯(lián)合組。si-NORAD、miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染入A549細胞，24 h后收集細胞對應檢測。

1.3.7 EdU 檢測細胞增殖 將37℃預熱的EdU工作液(20 μmol/L)加入6孔板，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，去除培養(yǎng)基，PBS 清洗細胞3 次，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，每孔用1 mL 細胞通透液(含0.3%Triton X-100 的PBS)，室溫孵育10～15 min，PBS清洗細胞3次后，每孔加入5 μL 碘化丙啶(PI)染色，熒光顯微鏡拍照。

1.3.8 細胞凋亡檢測 收集細胞，按照試劑盒操作說明，預冷乙醇固定后，加入10 μL Annexin V-FITC及PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨后置于冰浴中，上機檢測，F(xiàn)lowJo Dongle分析軟件進行分析。

1.3.9 熒光素酶檢測 將包含NORAD 與miR-26b-5p、miR-654-5p 結(jié)合位點的野生型(Wt)及突變型(Mut)序列的pmiGLO載體分別與miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 或NC 片段傳染A549 細胞，24 h后收集細胞，利用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素的表達。

1.3.10 Western blot 檢測 A549 細胞利用RIPA裂解，冰上孵育20 min后，4℃、14 000×g離心3～5 min，取上清液，BCA 定量，每孔按照20 μg 蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，分別以兔抗Ki-67(1∶800)、Bad(1∶800)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶800)及GAPDH(1∶10 000)，4℃、孵育過夜后，TBST 漂洗3次，加入HRP酶標抗兔二抗。加入ECL 發(fā)光液膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中掃描，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有實驗均重復三次，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計分析及繪圖。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，組織標本中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達采用配對t 檢驗，利用線性回歸分析肺癌組織中NORAD 與Ki-67、miR-26b-5p及miR-654-5p與Ki-67及NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA NORAD 在肺癌中的表達及其與Ki-67 表達的相關性 RNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，NORAD 在肺癌組織中的表達顯著升高(log2FoldChange=6.455，P=0.000)。qRT-PCR 檢 測 分析，與癌旁組織比較，肺癌組織中NORAD的表達顯著上調(diào)(t=6.430，P=0.000)；qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與HFL1細胞比較，肺癌細胞中NORAD 的表達顯著上調(diào)(F=46.910，P=0.000)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肺癌組織中Ki-67 的表達顯著升高(t=9.100，P=0.000)；線性回歸分析，肺癌組織中NORAD的表達與Ki-67的表達呈正相關(r=0.646，P=0.000)，見圖1。

圖1 NORAD在肺癌中的表達及其與Ki-67表達的相關性Figure 1 Expression of NORAD in lung cancer and its correlation with Ki-67 expression

2.2 肺癌中NORAD 互做miRNA 篩選及其在肺癌中的表達水平 利用在線分析軟件Starbase、Jefferson、miRDB 及miRNA 測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析NORAD 可能互做miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p、miR-654-5p為NORAD 候選互做miRNA。RNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p、miR-654-5p 在肺癌組織中的表達顯著降 低(log2FoldChange 分 別 為-3.654、-2.165，均P=0.000)，qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肺癌組織 中miR-26b-5p (t=6.821，P=0.000)與miR-654-5p(t=4.075，P=0.000)的表達顯著下調(diào)；與HFL1 細胞比較，肺癌細胞中miR-26b-5p (F=41.890，P=0.000)與miR-654-5p (F=39.260，P=0.000)的表達顯著下調(diào)(F=32.010，P=0.000)。直線回歸分析結(jié)果顯示，肺癌組織 中miR-26b-5p (r=-0.403，P=0.000)與miR-654-5p(r=-0.423，P=0.000)的表達與Ki-67 的表達呈負相關，見圖2。

圖2 肺癌中NORAD互做miRNA篩選及其在肺癌中的表達水平Figure 2 Screening and expression analysis of NORAD bound miRNA in lung cancer Screening of NORAD interacting miRNA in lung cancerand its expression level in lung cancer

2.3 肺癌中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達的相關性 經(jīng)直線回歸分析結(jié)果顯示，肺癌組織中，NORAD 與miR-26b-5p (r=-0.435，P=0.023)、miR-654-5p(r=-0.395，P=0.041)的表達呈負相關。熒光素酶檢測分析發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p mimics(t=14.270，P=0.000)、miR-654-5p mimics (t=13.310，P=0.000)與野生型NORAD 載體(Wt)共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶的表達顯著降低；而miR-26b-5p mimics (t=1.670，P=0.170)、miR-654-5p mimics (t=13.310，P=0.000)與 突 變 型NORAD載體(Mut)共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶的表達無顯著變化，見圖3。

圖3 肺癌中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達的相關性Figure 3 Correlation analysis of NORAD expression with miR-26b-5p and miR-654-5p in lung cancer

2.4 NORAD對肺癌細胞增殖及凋亡的影響 與Control組比較，抑制NORAD(si-NORAD)后，A549 細胞的增殖能力顯著降低；過表達miR-26b-5p、miR-654-5p 后，A549 細胞的增殖能力顯著降低；與si-NORAD 組比較，同時抑制NORAD 及過表達過表達miR-26b-5p、miR-654-5p 后，A549 細胞的增殖能力進一步降低。與Control 組比較，抑制NORAD 后，A549 細胞的凋亡比例顯著增加(t=10.250，P=0.000)；過表達miR-26b-5p (t=18.56，P=0.000)、miR-654-5p(t=10.030，P=0.000) 后，細 胞 凋 亡 顯 著 升 高；與si-NORAD 組比較，同時抑制NORAD 及過表達miR-26b-5p(t=7.960，P=0.001)、miR-654-5p(t=3.704，P=0.020)后，A549細胞的凋亡進一步升高，見圖4。

2.5 NORAD抑制后肺癌細胞中凋亡相關蛋白表達的變化 經(jīng)Western blot 檢測，與Control 組比較，si-NORAD 后，A549 細胞中Bad (t=9.498，P=0.000)、Cleaved caspase-3 (t=6.715，P=0.000)相對表達量均顯著升高，而Bcl-2 的相對表達量顯著降低(t=6.102，P=0.003)；miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics得到類似的結(jié)果。si-NORAD 與miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 聯(lián)合后，與si-NORAD 組比較，A549 細 胞 中Bad (t=3.374、5.715，P=0.025、0.005)、Cleaved caspase-3 (t=4.680、6.425，P=0.033、0.000)相對表達量進一步升高，而Bcl-2 的相對表達量顯著降低(t=2.946、6.153，P=0.042、0.00)，見圖5 和表2。

圖5 Western blot檢測肺癌細胞凋亡相關蛋白表達Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in lung cancer cells detected by Western blot

表2 凋亡相關蛋白的相對表達量(±s，n=3)Table 2 Relative expression of apoptosis-related proteins(±s,n=3)

表2 凋亡相關蛋白的相對表達量(±s，n=3)Table 2 Relative expression of apoptosis-related proteins(±s,n=3)

注：與Control組比較，aP＜0.01；與si-NORAD組比較，bP＜0.05；與si-NORAD組比較，cP＜0.01。Note:Compared with the Control group,aP＜0.01;Compared with si-NORAD group,bP＜0.05;Compared with si-NORAD group,cP＜0.01.

組別Control組miR-654-5p mimics組miR-26b-5p mimics組si-NORAD組si-NORAD+miR-654-5p mimics組si-NORAD+miR-26b-5p mimics組Cleaved Caspase-3 0.344±0.030 0.442±0.013a 0.516±0.017a 0.577±0.017a 0.649±0.019b 0.710±0.038c Bad 0.339±0.018 0.435±0.023a 0.521±0.021a 0.606±0.024a 0.711±0.027b 0.796±0.019c Bcl-2 0.5456±0.027 0.467±0.015a 0.429±0.019a 0.372±0.015a 0.311±0.013b 0.247±0.004c

3 討論

肺癌(lung cancer)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均排在惡性腫瘤前列[10]，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理表型，約占85%[11]。由于缺乏及時、有效的診斷方法，患者確診時已處于中晚期，與早期NSCLC相比，中晚期NSCLC 的治療反應性降低且預后差，導致NSCLC患者死亡率較高，5 年生存率約為15%[12]。近年研究認為，LncRNA 作為致癌基因或抑癌基因在腫瘤進展的過程中發(fā)揮著至關重要的作用，可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為，是腫瘤潛在的診斷和治療靶點[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織及人肺癌細胞株中，NORAD 的表達均顯著升高，暗示其與肺癌的發(fā)生及發(fā)展的關系密切。

LncRNAs作為miRNA“分子海綿”，發(fā)揮競爭內(nèi)源性RNA(ceRNAs)的功能來抑制miRNA 介導的靶標mRNA 的表達、調(diào)節(jié)細胞的增殖等行為[3-4]。LncRNA SNHG12 在肺癌中的表達顯著升高，可通過調(diào)節(jié)miR-320a/β-catenin軸抑制肺癌細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡[16]。肺癌組織中LncRNA HOXA-AS3的表達水平升高，而miR-340-5p 的表達水平降低，抑制HOXA-AS3表達可顯著抑制細胞增殖，細胞凋亡顯著增加，并增強DMS114/DDP 細胞順鉑敏感性，其作用機制可能與miR-340-5p 的表達上調(diào)有關[17]。LncRNA DANCR 在肺癌中的表達顯著升高，促進DANCR的表達，可顯著促進肺癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡，其機制可能通過抑制miR-216a的表達所致[18]。課題組通過RNA-seq 檢測分析發(fā)現(xiàn)，NORAD 在肺癌組織中的表達顯著升高，抑制NORAD 的表達可顯著抑制肺癌細胞增殖，增加細胞凋亡。利用在線分析軟件Starbase、Jefferson、miRDB 及miRNA測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析miR-26b-5p、miR-654-5p 為NORAD 候 選 互 做miRNA。miR-26b-5p、miR-654-5p 在肺癌組織中的表達顯著降低，促進miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達，可顯著抑制肺癌細胞增殖。以上結(jié)果暗示NORAD可能通過抑制miR-26b-5p、miR-654-5p的表達而影響肺癌細胞增殖。

研究證實，miRNA 主要通過與靶基因的3'-UTR結(jié)合后，抑制靶基因的表達而調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等行為，參與腫瘤的發(fā)生及進展，可作為多種腫瘤的診斷及治療靶點[19]。miRNA-146b-5p在肺癌組織中的表達顯著升高，其可能通過上調(diào)線皮素-1(LAD-1)的表達來促進細胞增殖，進而促進肺癌進展[20]。miR-520f和miR-143-3p在肺癌患者中表達降低，且與肺癌細胞增殖和侵襲行為以及肺癌患者的不良預后有關[21]。本研究通過RNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p、miR-654-5p在肺癌中的表達顯著降低，與肺癌細胞增殖關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者組織及血清中，miR-26b-5p 的表達顯著降低，肺癌細胞分泌包含miR-26b-5p的外泌體，調(diào)節(jié)肺癌放療敏感性[22]。在結(jié)直腸癌中，miR-654-5p 的表達顯著降低，導致HAX-1的表達上調(diào)，進而促進細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[23]。最近研究報道，包括LncRNA、環(huán)狀RNA(circRNA)等均可作為miRNA的“分子海綿”，影響miRNA的表達[3-4，24]。通過研究發(fā)現(xiàn)，NORAD可作為miR-26b-5p、miR-654-5p的“分子海綿”，抑制NORAD 及促進miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達，可顯著抑制肺癌細胞增殖。但miR-26b-5p、miR-654-5p 通過調(diào)控下游何種基因及通路而影響肺癌細胞增殖的，還需深入探討。

綜上所述，肺癌中NORAD的表達顯著上調(diào)，可能通過抑制miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達而促進肺癌細胞增殖，NORAD 可作為肺癌的診斷標志物。但由于本項目主要集中在細胞水平研究，后期擬通過動物水平進一步明確NORAD 與肺癌細胞增殖的關系；同時，miR-26b-5p、miR-654-5p 所調(diào)控的靶基因及下游通路尚需進一步明確。