基于量子點微球熒光免疫層析法定量檢測克百威的研究

張富生 陳 媛 鄧家軍 劉文娟 楊琳芬

（1. 江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心， 南昌330046； 2. 江西維邦生物科技有限公司， 南昌330027）

克百威（Carbofuran）， 又名呋喃丹、 蟲螨威， 屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥， 具有觸殺和胃毒的作用[1]，其毒理機制為抑制機體內(nèi)乙酰膽堿酶的活性， 破壞正常的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)， 引起異常興奮、 麻痹或死亡[2]。 該藥物通過內(nèi)吸殺蟲作用可用于防治大部分農(nóng)作物的蟲害。 克百威與大多數(shù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥不同的是， 其與乙酰膽堿酶的結(jié)合是不可逆的， 因此其毒性高且殘留時間長， 暴露在環(huán)境中對鳥類、蜜蜂和水生動物具有高毒性[3]。 美國環(huán)境保護署將其列為劇毒農(nóng)藥， 并于2009 年將其禁用[4]。 我國GB 2763-2021 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 中， 對食品中克百威的最大殘留限量為0.02～0.1 mg/kg[5]。

目前， 分析農(nóng)藥殘留常用的方法有酶抑制劑速測法、 色譜分析法和膠體金免疫層析法等。 其中，酶抑制劑速測法主要針對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[6]， 具有操作簡便、 成本低的特點， 但其檢測靈敏度不高， 一般檢測限在0.1～5 mg/kg， 且易受樣本基質(zhì)和環(huán)境的干擾， 出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況[7]。色譜分析法包括高效液相色譜法、 氣質(zhì)聯(lián)用分析法和液質(zhì)聯(lián)用分析法等， 具有靈敏度高、 準確性好、特異性強的優(yōu)點， 是目前國家標準和地方標準中檢測農(nóng)藥殘留的常用分析方法， 不過色譜分析法檢測時間長、 操作復(fù)雜、 費用高， 不適合大量樣本的現(xiàn)場篩查[8～10]。 膠體金免疫層析法具有快速、 簡便和費用低等優(yōu)點， 但該檢測方法靈敏度較差， 一般只用于定性分析[11]。 隨著國家對快速檢測產(chǎn)品性能要求的提高， 如何在準確定量分析方面有所突破， 是科研人員未來的研究重點[12]。 因此， 建立一種靈敏度高、 操作簡便、 可現(xiàn)場使用的快速定量免疫層析方法具有重要的意義[13～14]。

量子點微球 （Quantum microspheres， QM） 是將量子點包裹進納米級聚苯乙烯微球中制備出的新型量子點標記材料， 是一種性能優(yōu)異的生物標記材料[15～16]。 已有研究表明， 用量子點微球熒光免疫層析 （QM-LFA） 法制備的試紙條檢測蔬菜中的吡蟲啉、 噻蟲胺、 噻蟲嗪， 靈敏度分別為14.58、0.27、 0.36 ng/mL[17]。 吳爍等[18]用熒光微球免疫層析方法定量檢測水產(chǎn)品中4 種硝基呋喃代謝物。 DUAN等[19]以124 nm 的QM 制備的試紙條檢測赭曲霉毒素的靈敏度為0.39 ng/mL。 本研究以QM 為標記材料， 以制備的克百威單克隆抗體-QM 復(fù)合物為探針， 通過優(yōu)化抗體標記量、 抗原噴膜濃度、 探針體積等主要參數(shù)， 建立快速定量檢測克百威的量子點微球熒光免疫層析法。

一、 材料與方法

（一） 試劑與儀器

1. 主要試劑材料。 量子點微球 （QM 為1%固體含量，W/V； 激發(fā)波長為365 nm， 發(fā)射波長為615 nm， 江西維邦生物科技有限公司）； 克百威單克隆抗體和偶聯(lián)抗原 （江西維邦生物科技有限公司）； 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC， 上海生工生物工程股份有限公司）； 羊抗鼠IgG 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；硝酸纖維素膜CN95 ［賽多利斯 （中國） 有限公司］； 吸水紙、 樣本墊和結(jié)合墊 （上海金標生物技術(shù)有限公司）； 克百威、 啶蟲脒、 吡蟲啉、 三唑磷和三唑酮等農(nóng)藥標準品 （德國DR.E 公司）； 其他試劑均為分析純。

2.主要儀器設(shè)備。 XYZ-3000 噴金點膜儀（美國Bio-Dot 公司）； Milli-Q 水處理儀（美國Millipore 公司）； 恒溫干燥箱 （上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）； 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 （上海智城分析儀器制造有限公司）； 熒光試紙條檢測儀 （江西維邦生物科技有限公司， LED 光源， 激發(fā)波長365 nm±20 nm， 檢測波長615 nm±20 nm）。

（二） 試驗方法

1. 探針的制備。 采用EDC 將QM 表面的羧基與克百威單克隆抗體上的氨基偶聯(lián)， 取5.0 μL QM（10 mg/mL，W/V） 加入1 mL 0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 6.0） 中， 混勻后超聲1 min， 加入5.0 μL 0.5 mg/mL 的EDC 溶液 （現(xiàn)配現(xiàn)用）， 充分混勻后將其置于37℃搖床以250 r/min 反應(yīng)15 min。將緩沖液1/10 體積 （100 μL） 的克百威單克隆抗體 （濃度分別為10、 20、 30 μg/mg） 滴加到該溶液中。 置于37℃搖床以250 r/min 反應(yīng)1 h， 加入100 μL 封閉液［通過將1.0 g 牛血清白蛋白加入10 mL 0.05 mol/L 的硼酸緩沖液（pH 7.0） 中制得］ 封閉1 h。 取出后在4℃下以14 000 r/min 離心20 min， 棄上清液， 用800 μL 復(fù)溶液 ［通過將0.02 g BSA 和0.05 mL 吐溫-20 加入10 mL 0.01 mol/L 的硼酸緩沖液（pH 7.0） 中制得］ 溶解沉淀物。

2. 硝酸纖維素膜 （NC 膜） 上檢測線 （T 線）和質(zhì)控線（C 線） 的噴涂。 檢測線： 將克百威偶聯(lián)抗原用0.01 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液分別稀釋成0.8、 1.0、 1.2 mg/mL， 用XYZ-3000 噴金點膜儀將稀釋好的抗原溶液劃到NC 膜 （CN95） 上，標記為T 線， 抗原噴膜量為0.74 μL/cm。 質(zhì)控線：將羊抗鼠IgG 抗體用0.01 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋成1 mg/mL， 用XYZ-3000 噴金點膜儀將稀釋好的抗體噴到NC 膜 （CN95） 上， 標記為C 線， 抗體噴膜量也為0.74 μL/cm。 檢測線與質(zhì)控線兩線之間間隔5 mm。 噴涂好兩條線的NC 膜放置于37℃恒溫干燥箱中干燥4 h。

3. 試紙條的組裝。 將NC 膜、 結(jié)合墊、 樣本墊和吸水墊按照組裝順序粘貼， 粘貼好后用切條機切成4 mm 寬的試紙條， 裝入塑料卡殼中， 備用。

4.QM-LFA 檢測方法與結(jié)果判定。 樣本前處理后取100 μL 滴加到組裝好的試紙條加樣孔中，10 min 后， 用熒光試紙條檢測儀讀取檢測線和質(zhì)控線信號強度的比值 （T/C） 結(jié)果。 量子點微球熒光免疫層析法檢測原理見圖1。

圖1 量子點微球熒光免疫層析法檢測原理

結(jié)果判定： 通過熒光試紙條檢測儀讀取T/C 值數(shù)據(jù)， 將數(shù)據(jù)代入到本方法建立的標準曲線方程式中， 計算樣本中克百威的濃度。 通過計算20 個陰性樣本實際測得值的平均值加上3 倍標準差， 確定本方法的檢測限 （LOD）。 標準曲線上半抑制率（IC50） 對應(yīng)的標準品濃度為本方法的IC50值[14]。

5.QM-LFA 方法最佳條件的確定。 以QM 上克百威抗體標記量、 抗原噴膜濃度、 探針體積為因素， 設(shè)計3 因素3 水平的正交試驗 （見表1）， 優(yōu)化本試紙條工藝參數(shù)。 選取抑制率最高的條件為最佳工藝條件。

表1 3 因素3 水平正交試驗表

6. 檢測時間的確定。 免疫層析試紙條的免疫學(xué)反應(yīng)是一個動態(tài)的反應(yīng)過程。 在這個過程中T/C值會隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)出一個動態(tài)的變化過程， 當(dāng)反應(yīng)到達一定時間后T/C 值會逐漸趨于穩(wěn)定， 因此對免疫層析方法進行免疫動力學(xué)分析很有必要。 本研究對量子點微球熒光免疫層析試紙條共進行20 min 的免疫動力學(xué)分析， 每30 s 記錄1 次T/C 值， 以檢測時間為X軸， T/C 值為Y軸繪制免疫動力學(xué)曲線以確定試紙條的檢測時間。

7. 標準曲線的建立。 將克百威標準品用甲醇溶解， 并用0.01 mol/L pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液配制成 濃 度 為0.05、 0.10、 0.15、 0.25、 0.50、 0.80、1.00、 1.50、 2.00 ng/mL 的標準溶液， 用最佳條件進行檢測， 每個濃度平行檢測3 次， 繪制標準曲線。

8. 特異性試驗。 在空白樣本中分別添加啶蟲脒、 吡蟲啉、 三唑磷、 三唑酮、 3-羥基克百威、異丙威、 仲丁威、 丁硫克百威、 丙硫克百威和甲萘威， 使其終濃度均達1 000 μg/L， 用最佳條件制備的試紙條進行檢測， 計算每種交叉反應(yīng)物質(zhì)相對應(yīng)的IC50值， 以得到交叉反應(yīng)率， 每個交叉反應(yīng)物質(zhì)均平行檢測3 次。

9. 準確度和精密度考察。 通過在12 個不同基質(zhì)樣本中進行加標回收試驗來驗證方法的檢測準確度和精密度。 將樣本勻漿后進行加標， 克百威的加標濃度為0、 10 μg/kg， 混合后放置過夜 （每個樣本重復(fù)2 次）。 試驗時稱取2 g 加標樣本到50 mL離心管中， 加入5 mL 克百威樣本提取劑后漩渦振蕩1 min， 取1 mL 液體加入1.5 mL 離心管中， 以4 000 r/min 離心2 min， 離心后取上清液， 用樣本稀釋液稀釋20 倍 （不同樣本可以按照檢測限調(diào)整稀釋倍數(shù)） 后進行檢測， 得到檢測結(jié)果并計算回收率和變異系數(shù)（CV）。 回收率的計算公式為“檢測值/加標值×100%”， CV 計算公式為“檢測均值標準偏差（SD） /檢測均值（AE） ×100%”。

二、 結(jié)果與分析

（一） QM-LFA 方法的最佳條件 正交試驗優(yōu)化結(jié)果見表2。 如表2 所示， 當(dāng)QM 上克百威單克隆抗體標記濃度為20 μg/mg、 抗原噴膜濃度為0.8 mg/mL、 探針體積為0.8 μL 時 （第4 組）， 檢測0.2 ng/mL 陽性標準品的抑制率最高， 為67.58%，因此， 選擇該條件為最佳優(yōu)化條件。

表2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

（二） 檢測時間的確定 以檢測時間為X軸、T/C 值為Y軸繪制的免疫動力學(xué)曲線見圖2。 由圖2可知， 試紙條在檢測不同濃度（0、 0.5 ng/mL） 樣品時， T/C 值均于檢測開始10 min 后達到基本平衡，即試紙條的最佳免疫動力學(xué)反應(yīng)時間為10 min。

圖2 量子點微球熒光免疫層析法免疫動力學(xué)曲線

（三） 標準曲線的建立 以克百威濃度的對數(shù)為橫坐標， 并以T/C 值數(shù)據(jù)為縱坐標作圖， 建立標準曲線 （見圖3）。 該標準曲線的線性回歸方程為y＝-1.398 4 lgx+0.820 9， 回歸系數(shù)R2＝0.991 1，定量檢測范圍為0.05～2.00 ng/mL， LOD 為0.025 ng/mL， IC50為0.506 ng/mL。

圖3 量子點微球熒光免疫層析法標準曲線

（四） 特異性試驗結(jié)果 特異性是評價免疫層析試紙條產(chǎn)品質(zhì)量的指標之一， 反應(yīng)的是產(chǎn)品針對待檢物質(zhì)的特異性識別能力， 其也是影響產(chǎn)品假陽性率高低的關(guān)鍵因素之一。 本方法的特異性試驗結(jié)果表明， 方法對啶蟲脒、 吡蟲啉、 三唑磷、 三唑酮以及與克百威結(jié)構(gòu)相類似的3-羥基克百威、 異丙威、 仲丁威、 丁硫克百威、 丙硫克百威和甲萘威的交叉反應(yīng)率均小于0.01%， 說明本方法特異性良好。 但考慮到農(nóng)藥品種較多， 不同地域和果蔬中使用的農(nóng)藥品種千差萬別， 在后續(xù)研究中應(yīng)繼續(xù)考察和其他農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率情況。

（五） 準確度和精密度 本方法對12 個已經(jīng)用確證方法確定為陰性的蔬果樣本進行加標回收試驗， 結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示， 未加標樣本檢測結(jié)果均為陰性 （＜0.05 μg/kg）； 在樣本中加標10 μg/kg時， 檢測回收率為81.65%～129.02%， 表明方法具有較好的準確度。 計算本次加標回收2 個平行之間檢測結(jié)果的變異系數(shù)， 為0.20%～21.95%， 其中11 個樣本的變異系數(shù)在0.20%～16.37%之間，精密度良好， 只有小青菜樣本變異系數(shù)為21.95%，可能是因為樣本加標的2 個平行是分別稱樣制備的， 考慮為稱樣和混勻過程帶來的誤差。

表3 QM-LFA 試紙條的準確度和精密度

三、 結(jié)論

通過對抗體標記量、 抗原噴膜濃度和探針體積的優(yōu)化， 建立了定量檢測克百威的量子點微球熒光免疫層析法。 本方法的LOD 為0.025 ng/mL， IC50為0.506 ng/mL， 定 量 檢 測 范 圍 為0.05 ～2.00 ng/mL， 線性較好 （R2＝0.991 1）。 本方法操作簡便、 快速、 靈敏度高、 可定量、 無需專業(yè)人員和昂貴儀器設(shè)備， 特別適合在基層現(xiàn)場檢測工作中使用， 有望在食品農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測中發(fā)揮有效作用。