增強(qiáng)型脂肪凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛羊可食性組織中碘醚柳胺殘留

董文婷 曾 勇 盧 芳 舒金秀 吳曉翠 馮超林 周 青 文靜靜

（湖北省獸藥監(jiān)察所， 武漢430070）

牛、 羊的可食性組織具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 深受廣大消費(fèi)者的喜愛。 牛、 羊肉制品的質(zhì)量問題也成為了全世界共同關(guān)注的食品安全問題[1～3]。 獸藥在牛、 羊的規(guī)?；B(yǎng)殖[4～6]中的應(yīng)用， 一方面可以有效預(yù)防和治療動(dòng)物疾病， 但另一方面也會(huì)給牛、羊組織帶來潛在的殘留危害。 不規(guī)范的用藥或者不遵守休藥期， 都會(huì)引發(fā)獸藥殘留問題， 對(duì)人類的身體健康帶來不良影響。

肝片吸蟲病是一種人畜共患的食源性寄生蟲病， 尤其以牛、 羊等反芻動(dòng)物最容易感染， 該病在我國(guó)各省呈區(qū)域性流行， 是影響較嚴(yán)重的、 分布范圍較廣的寄生蟲病之一。 在發(fā)病過程中， 會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物瘦弱、 發(fā)育障礙， 從而致使肉質(zhì)產(chǎn)量降低或質(zhì)量下降， 給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。 對(duì)于肝片吸蟲病的防治， 目前主要靠抗吸蟲藥物來維持[7～10]。 動(dòng)物發(fā)病后， 要及時(shí)用藥物進(jìn)行治療。 而新型的抗吸蟲藥物碘醚柳胺， 既對(duì)成蟲有效， 又對(duì)6 周齡以上童蟲有效， 是防治肝片吸蟲病的較理想的藥物。

隨著碘醚柳胺藥物的廣泛應(yīng)用和研究， 發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性， 而且易導(dǎo)致抗藥性。 為了保障動(dòng)物源性食品的安全， GB 31650-2019 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》 已制定了碘醚柳胺的最大殘留限量， 殘留監(jiān)測(cè)對(duì)象有牛、 羊的肌肉、 脂肪、 肝臟和腎臟。 國(guó)內(nèi)目前針對(duì)碘醚柳胺在牛羊組織體內(nèi)殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚未建立， 以往文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于抗吸蟲藥殘留的常用分析方法也主要以免疫學(xué)法[11]、 液相色譜法[12～13]、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14～16]為主。 免疫學(xué)法檢測(cè)針對(duì)性差、 假陽(yáng)性率高[17]， 而液相色譜法配制流動(dòng)相需要消耗大量試劑， 對(duì)環(huán)境影響較大。 目前國(guó)內(nèi)關(guān)于碘醚柳胺殘留檢測(cè)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究主要針對(duì)的是牛羊肉和牛乳， 能同時(shí)檢測(cè)牛羊的肝臟、 脂肪、 腎臟的研究報(bào)道較少， 不能滿足GB 31650-2019 殘留監(jiān)測(cè)范圍的要求， 而且是用外標(biāo)法定量， 不能消除實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)效應(yīng)的干擾， 且定量限較高。 為了健全我國(guó)相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)體系，與國(guó)際接軌[18～20]， 擴(kuò)大與世界各國(guó)的貿(mào)易往來， 從源頭上保障動(dòng)物源性食品安全， 非常有必要建立測(cè)定牛羊可食性組織中碘醚柳胺殘留的檢測(cè)方法。 本研究擬建立Captiva EMR-Lipid 增強(qiáng)型脂肪去除凈化柱凈化， 結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉、 牛脂肪、 牛肝、 牛腎、 羊肉、 羊脂肪、 羊肝、 羊腎中碘醚柳胺殘留的檢測(cè)方法， 以期為碘醚柳胺藥物的監(jiān)管提供有效方法支撐。

一、 材料與方法

（一） 材料與試劑 牛和羊的肌肉、 腎臟、 肝臟和脂肪樣品采集于湖北省武漢市江夏區(qū)、 宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)縣、 黃岡市羅田縣的屠宰場(chǎng)。 將采集的樣品絞碎并均質(zhì)， 置于密封盒中， 在-18℃以下冷凍保存， 待分析檢測(cè)。

乙腈、 甲醇和氨水（色譜純， 美國(guó)默克公司）；碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)品 （含量≥99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）。 0.1%氨水溶液： 取氨水1 mL， 用水稀釋至1 000 mL。 除另有說明外， 本研究中溶液所涉及的符號(hào)“%” 均指溶液100 mL 里含有溶質(zhì)若干毫升， 即為V/V。

（二） 儀器 與設(shè)備 SCIEX TRIPLE QUAD 6500+液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀 ［配有電噴霧離子源 （ESI）， 美國(guó)AB SCIEX 公司］； VORTEX渦旋混合儀 （德國(guó)IKA 公司）； 3K30 高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）； Milli-Q 超純水儀 （美國(guó)Millipore 公司）； 5982-911 固相萃取裝置 （美國(guó)Agilent 公司）； AE260 電子天平 （瑞士Mettler Toledo公司）； Captiva EMR-Lipid 增強(qiáng)型脂肪去除凈化柱（300 mg/3 mL， 美國(guó)Agilent 公司）。

（三） 實(shí)驗(yàn)方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 （100 μg/mL）：精密稱定碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg， 分別置于100 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容， 配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 于-18℃保存， 有效期3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 μg/mL）： 準(zhǔn)確量取100 μg/mL的碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL，于100 mL 容量瓶中， 用乙腈稀釋至刻度， 配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)工作液， 于-18℃保存， 有效期1 個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/L）： 準(zhǔn)確量取1 μg/mL 的碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL，于100 mL 容量瓶中， 用乙腈稀釋至刻度， 配制成質(zhì)量濃度為10 μg/L 的碘醚柳胺、 碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)工作液， 現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.樣品前處理。 取樣品各2 g（準(zhǔn)確至±0.02 g），置于50 mL 塑料離心管中， 添加碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)工作液 （1 μg/mL）50 μL， 加入陶瓷均質(zhì)子和10 mL 乙 腈， 渦 旋 混 勻2 min， 在4℃下 以10 000 r/min 離心5 min， 取上清液， 殘?jiān)貜?fù)提取1 次，合并上清液， 用乙腈定容至20 mL。 取2.4 mL 上清液， 加入0.6 mL 水混勻， 加入Captiva EMRLipid 增強(qiáng)型脂肪去除凈化柱中， 重力自流。 收集洗脫液混合均勻， 過0.22 μm 微孔濾膜， 供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

3. 色譜條件。 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）； 流速0.3 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL； 柱溫30℃； 流動(dòng)相A 相0.1%氨水溶液， 流動(dòng)相B 相甲醇。 梯度洗脫條件：0～5.0 min， 70% A→0% A； 5.0～8.0 min， 0%A； 8.0～8.1 min， 0%A→70%A； 8.1～10.0 min，70%A。

4. 質(zhì)譜條件。 負(fù)離子模式掃描； 電噴霧離子源； 噴霧電壓-4 500 V； 離子源溫度550℃； 輔助加熱氣壓力413.69 kPa； 霧化氣壓力379.21 kPa；氣簾氣壓力 241.32 kPa； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。 碘醚柳胺及內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、 去簇電壓及碰撞能量見表1。

表1 碘醚柳胺及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

二、 結(jié)果與分析

（一） 前處理方法的優(yōu)化

1. 提取溶劑的選擇。 針對(duì)牛羊的肌肉、 脂肪、肝臟以及腎臟中碘醚柳胺的提取， 分別考察了1%三乙胺乙腈溶液、 乙腈-丙酮溶液 （60∶40）、 乙腈、 甲醇、 乙酸乙酯等5 種提取試劑對(duì)碘醚柳胺平均回收率的影響， 結(jié)果見圖1。 結(jié)果顯示， 采用甲醇、 乙酸乙酯提取時(shí)， 碘醚柳胺平均回收率只有35%～55%， 回收率低且不穩(wěn)定； 采用1%三乙胺乙腈溶液、 乙腈-丙酮溶液（60∶40） 提取時(shí)， 碘醚柳胺平均回收率可達(dá)到70%～75%， 其中1%三乙胺乙腈溶液對(duì)脂肪中藥物的溶解性更強(qiáng)， 乙腈-丙酮溶液（60∶40） 對(duì)肌肉、 肝臟有比較好的提取效果， 但兩個(gè)提取液都容易渾濁， 而且基質(zhì)效應(yīng)明顯； 采用乙腈提取時(shí)， 碘醚柳胺平均回收率可達(dá)到80%以上， 滿足回收率條件的同時(shí)， 基質(zhì)干擾少。因此， 本研究最終選擇乙腈作為提取試劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)碘醚柳胺平均回收率的影響 （n＝6）

2. 凈化條件的選擇。 考慮到動(dòng)物源性食品的主要基質(zhì)干擾是蛋白質(zhì)、 脂肪， 以及碘醚柳胺藥物呈弱酸性的特點(diǎn)， 本研究對(duì)碘醚柳胺的凈化方法進(jìn)行了考察。 實(shí)驗(yàn)中分別比較了使用PAX （60 mg/3 mL）、 PAX （500 mg/6 mL）、 MAX （60 mg/3 mL）、MAX（150 mg/6mL）、 WAX （60 mg/3 mL）、 PRiME HLB （200 mg/6 mL） 和Captiva EMR-Lipid 等7種凈化柱凈化后的碘醚柳胺平均回收率高低， 結(jié)果見圖2。 結(jié)果顯示， Captiva EMR-Lipid 小柱回收率較高， 能有效去除脂肪提取物中的大量脂肪干擾物， 可最大限度減少對(duì)色譜柱和儀器的污染， 提取液直接通過小柱即可得到充分的凈化， 然后收集流出液， 稀釋上機(jī)測(cè)定， 整個(gè)過程簡(jiǎn)便， 利于操作。這種增強(qiáng)型脂肪凈化技術(shù)， 保留脂質(zhì)的機(jī)理是基于填料對(duì)于長(zhǎng)鏈化合物空間結(jié)構(gòu)的選擇性以及反相保留機(jī)理的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)于脂類化合物的高選擇保留。 PAX （60 mg/3 mL）、 MAX （60 mg/3 mL），屬于強(qiáng)陰離子交換柱， 適用于弱酸性藥物的分離，當(dāng)提取液通過強(qiáng)陰離子交換柱后， 藥物也能得到保留。 但是使用起來較為繁瑣， 需要用5 mL 的25%氨水乙腈溶液活化， 備用液過柱以后， 用5 mL 乙腈淋洗， 抽干， 再用5 mL 的5%甲酸乙腈溶液洗脫， 收集洗脫液水浴氮?dú)獯蹈梢院蟛拍軓?fù)溶上機(jī)測(cè)定。 因此， 綜合考慮以上因素， 本研究最終選擇了Captiva EMR-Lipid 作為凈化柱。

圖2 不同凈化柱對(duì)碘醚柳胺平均回收率的影響 （n＝6）

3. 色譜條件的選擇。 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱作為液相柱， 它屬于通用型、 高密度封端， pH 耐受范圍較寬， 能有較好的分離度。流動(dòng)相比較了甲醇與5 mmol 乙酸銨緩沖溶液、0.1%甲酸水溶液、 超純水、 0.1% 氨水溶液4 種組合的體系對(duì)碘醚柳胺峰形、 靈敏度及分辨率的影響。 研究表明， 選擇甲醇-超純水作為流動(dòng)相時(shí)，碘醚柳胺出峰時(shí)間較晚， 峰形較寬（見圖3A）； 選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)， 碘醚柳胺響應(yīng)較低（見圖3B）； 相對(duì)于甲醇-5 mmol 乙酸銨緩沖溶液的流動(dòng)相體系， 在選擇甲醇-0.1% 氨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)， 碘醚柳胺峰形更好， 保留時(shí)間更短且質(zhì)譜響應(yīng)更高 （見圖3C 和圖3D）。 因此，本研究選擇甲醇-0.1%氨水溶液作為液相色譜的流動(dòng)相。

圖3 不同流動(dòng)相體系下碘醚柳胺 （20 μg/L 溶劑標(biāo)準(zhǔn)品） 的MRM 圖

（二） 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)及定量方法確定 本研究對(duì)牛肉、 牛脂肪、 牛肝、 牛腎、 羊肉、 羊脂肪、 羊肝、 羊腎按照上文“材料與方法” 中“2. 樣品前處理” 進(jìn)行前處理后添加碘醚柳胺， 進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察[21]， 結(jié)果見表2。 如表2 所示， 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率的比值范圍在80.70%～83.50%（<100%）。 通過SPSS 軟件比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率的顯著性差異情況， 按照離子響應(yīng)強(qiáng)度比在85%～115%之間不存在較明顯基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 得出基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液具有較弱的基質(zhì)抑制作用。 本研究采用碘醚柳胺-13C6內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量， 消除了前處理操作中的誤差， 排除了基質(zhì)抑制干擾， 同時(shí)省去了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液配置的繁瑣步驟， 該定量方法獲得的碘醚柳胺回收率高且穩(wěn)定， 也提高了實(shí)際應(yīng)用中碘醚柳胺含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

表2 不同樣品中碘醚柳胺目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)

（三） 方法的線性關(guān)系 精密量取1 μg/mL 和10 μg/L 碘醚柳胺和碘醚柳胺-13C6標(biāo)準(zhǔn)工作液適量， 用80%乙腈水溶液稀釋成濃度為0.05、 0.50、1.00、 5.00、 20.00、 100.00 μg/L， 內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液， 臨用現(xiàn)配， 供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。 每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3 次，以碘醚柳胺和其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜峰的面積比值作為縱坐標(biāo)， 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 結(jié)果顯示， 碘醚柳胺在0.05～100.00 μg/L 的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 線性方程為Y＝250.08X+73.97， 相關(guān)系數(shù)（r2） 為0.998 4。

（四） 方法的檢出限、 定量限、 平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 采用空白牛羊可食性組織中添加碘醚柳胺藥物的方法， 將經(jīng)過本方法處理上機(jī)測(cè)定得到的特征離子色譜峰信噪比大于或等于3 時(shí)的最低濃度作為方法檢出限， 將信噪比大于或等于10 時(shí)的最低濃度定為方法定量限。 考慮到碘醚柳胺在牛羊可食性組織中的最大殘留限量（牛肝中殘留限量值最低， 為10 μg/kg）， 將碘醚柳胺的檢出限定為1 μg/kg， 定量限定為2 μg/kg， 可完全滿足日常監(jiān)測(cè)需求， 并以此進(jìn)行添加回收驗(yàn)證。 2 μg/kg 添加水平下將羊脂肪樣品經(jīng)前處理后進(jìn)行檢測(cè)， 所得到的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖4， 信噪比為305.9，遠(yuǎn)大于10。

圖4 羊脂肪添加2 μg/kg 碘醚柳胺的特征離子質(zhì)量色譜圖

在空白的牛肉、 牛脂肪、 牛肝、 牛腎、 羊肉、羊脂肪、 羊肝、 羊腎基質(zhì)樣品中分別添加2、 20、100 μg/kg 3 個(gè)濃度水平的碘醚柳胺進(jìn)行回收率試驗(yàn)， 每個(gè)濃度需進(jìn)行5 個(gè)平行試驗(yàn)[22～24]， 重復(fù)進(jìn)行3 次， 結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示， 本方法在2～100 μg/kg 的添加濃度范圍內(nèi)平均回收率為90.0%～103.0%， 批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.1%， 批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.4%。 本方法靈敏度高， 準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性都較好， 能滿足殘留分析方法的需求。

表3 牛羊可食性組織中添加碘醚柳胺的回收率及精密度

（五） 實(shí)際樣品檢測(cè) 采用本方法對(duì)湖北省武漢市、 宜昌市、 荊門市、 荊州市、 黃石市、 隨州市共計(jì)35 批次牛肉樣品進(jìn)行檢測(cè)， 其中檢測(cè)出1 個(gè)批次牛肉含碘醚柳胺10.12 μg/kg。

三、 結(jié)論

本研究通過使用增強(qiáng)型脂肪凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了測(cè)定牛羊可食性組織中碘醚柳胺藥物殘留量的方法， 根據(jù)碘醚柳胺藥物特點(diǎn)[25]， 對(duì)提取溶劑、 凈化條件、 色譜條件、 基質(zhì)效應(yīng)和定量方法等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化確定。 本方法的線性關(guān)系、 靈敏度、 準(zhǔn)確度以及精密度均可以達(dá)到獸藥殘留分析要求， 后期研究可以擴(kuò)大抗吸蟲類藥物的種類范圍， 建立牛羊可食性組織中多種藥物殘留的監(jiān)測(cè)方法， 為畜牧業(yè)生產(chǎn)以及今后食品安全大數(shù)據(jù)分析提供更好的技術(shù)支撐。