蜂毒肽分離純化及基于氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法的定值方法研究

史浩川 楊夢瑞 翟 睿 強 維 劉香艷 周 劍 嚴晨斌 王 敏

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室， 北京100081；2. 中國計量科學研究院， 北京100029； 3. 上海安譜實驗科技股份有限公司， 上海201609）

肽是由2 個或2 個以上氨基酸以不同的排列組合方式通過肽鍵連在一起而形成的化合物的總稱。小分子肽作為蛋白質(zhì)中的活性片段， 具有抗炎、 抗氧化、 增強免疫力等獨特的生理活性。 近年來， 為滿足農(nóng)業(yè)提質(zhì)增效及營養(yǎng)導向型農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來的新需求， 來源于特色農(nóng)產(chǎn)品的活性多肽成為研究熱點。 蜂毒是蜜蜂尾部蟄刺腺內(nèi)的有毒液體， 主要成分包括多肽類、 酶類、 胺類及其他物質(zhì)[1～2]。 其中，蜂毒肽 （Melittin） 是由26 個氨基酸殘基（GIGAV LKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2） 構(gòu)成的一種功能活性多肽， 具有較強的生物活性， 在抗菌[3]、抗炎[4]、 免疫調(diào)節(jié)[5]等方面具有很好的功效， 是當前蜂產(chǎn)業(yè)、 保健食品、 化妝品、 醫(yī)藥等領(lǐng)域的熱點研究對象。

我國是養(yǎng)蜂大國， 蜂毒資源較為豐富， 從蜂毒中有效地分離純化獲得蜂毒肽是研究其功能活性的基礎(chǔ)與關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 由于蜂毒成分較為復(fù)雜， 存在磷脂酶 （PLA2） 及其他一些致敏蛋白， 同時PLA2與蜂毒肽四聚體相對分子質(zhì)量接近， 加大了蜂毒肽的分離純化難度[6]。 蜂毒肽分離純化過程中如果不能有效去除過敏源， 將極大地限制蜂毒肽在保健食品、 化妝品等領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用[7]。 雖然根據(jù)蜂毒肽氨基酸序列可以通過化學合成、 生物工程等技術(shù)手段獲得， 但是化學合成的成本較高， 而基因重組蛋白表達方式對功能活性有一定影響[8]。 此外，蜂毒肽在蜂毒中的含量較高， 從蜂毒中直接分離純化蜂毒肽仍是目前常用的制備方法。 常見的分離純化方法主要有溶劑萃取法[9]、 柱層析法[10]、 高速逆流色譜法[11]、 高效液相制備色譜法等[12～14]。

目前， 由于企業(yè)的生產(chǎn)方式和質(zhì)量控制措施不同， 市場上蜂毒肽類產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊。 因此，準確測定蜂毒肽純品含量對蜂毒肽產(chǎn)品質(zhì)量控制非常關(guān)鍵。 當前有關(guān)蜂毒肽含量測定的標準方法尚未見報道， 而隨著生物計量技術(shù)的發(fā)展， 一些高準確度的多肽、 蛋白質(zhì)含量測定方法逐漸被報道， 主要包括質(zhì)量平衡法[15]、 同位素稀釋質(zhì)譜法[16～17]等。 質(zhì)量平衡法是通過逐一扣減結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)、 水分、揮發(fā)性溶劑、 無機雜質(zhì)等， 從而得到多肽純度的間接測量方法。 同位素稀釋質(zhì)譜法主要是基于多肽水解成氨基酸的方式， 以同位素標記的氨基酸為內(nèi)標的質(zhì)譜測量方法， 被認為是一種絕對的多肽、 蛋白質(zhì)定量測定方法， 并能通過氨基酸標準物質(zhì)建立量值溯源性。 此外， 定量核磁法、 電噴霧-差分電遷移率-粒子計數(shù)法、 高效液相色譜-圓二色光譜法等也在多肽含量測定中得到應(yīng)用。

本研究擬采用高效液相制備色譜法， 通過優(yōu)化色譜分離純化條件得到蜂毒肽純品， 并對本純品建立基于水解產(chǎn)物異亮氨酸分析的同位素稀釋質(zhì)譜法， 重點考察水解液的濃度、 水解溫度及水解時間3 個水解條件對定值結(jié)果的影響。 本研究旨在建立蜂毒肽分離純化及純度定值方法， 同時以期為其他多肽的分離純化及絕對含量的檢測提供參考， 為實驗室蛋白質(zhì)檢測的溯源提供思路。

一、 材料與方法

（一） 實驗材料 SYNAPT G2-Si 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS， 美國Waters 公司）； Q Exactive HF 高分辨軌道阱液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TG-50A 熱重分析儀 （日本Shimadzu 公司）；Dionex ICS-3000 離子色譜儀 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）； AL104 分析天平（瑞士Mettler 公司）； XS105 分 析 天 平 （瑞 士Mettler 公 司）；EFAA-DC24-RT 氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）； Touch mixer MT-51 渦旋振蕩儀 （日本Yamato 公司）； D2012plus 高速離心機 （美國SCILOGEX 公司）； OKFKJ-2 氫氧焰安瓿瓶熔封機 （湖南沃克能源科技有限公司）； KINETEX C18色譜柱 （2.1 mm×150 mm， 3.5 μm， 美國Phenomenex 公 司）； Athena C18-BIO （4.6 mm×250 mm， 5 μm； 10.0 mm×250 mm， 5 μm； 上海安譜實驗科技股份有限公司）。

蜂毒凍干粉 （金蜜蜂生物科技有限公司）； 異亮氨酸GBW （E） 100057 （純度99.4%±1.5%， 中國計量科學研究院）； 異亮氨酸標記物 （D10， 氘代率為99.0%， 純度為98%±2%， 加拿大Toronto Research Chemicals 公司）； 其他試劑均為色譜純。

（二） 實驗方法

1. 蜂毒肽分離純化及液相純度。 取1 g 蜂毒凍干粉溶于1 mL 純水， 在20℃冰水浴中超聲提取2 min 后， 以14 000 r/min 離心5 min， 上清液過0.45 μm 聚醚砜濾膜， 沉淀加入0.5 mL 純水復(fù)溶。 重復(fù)上述操作兩次， 將上清液合并后在2 500 r/min條件下渦旋5 min， 待測。

色譜柱為Athena C18-BIO （10.0 mm×250 mm，5 μm）； 流動相A 相為甲酸-水 （2∶998，V/V）；流動相B 相為乙腈。 一次純化液相色譜梯度洗脫程 序： 0 ～2 min， 95% A、 5% B； 2 ～35 min，95% A→40% A、 5% B→60% B； 35～45 min，40% A→5% A、 60% B→95% B； 45 ～50 min，5% A、 95% B； 50 ～51 min， 5% A →95% A、95%B→5%B； 51～60 min， 95%A、 5% B。 流速3.6 mL/min， 進樣量100 μL， 洗脫時間60 min。用紫外檢測器在280 nm 波長處檢測蜂毒肽流分，收集蜂毒肽流分并在-80℃條件下預(yù)凍、 凍干， 獲得蜂毒肽粗品。 取0.5 g 凍干后的蜂毒肽溶于1 mL純水， 流動相A 相為三氟乙酸-水 （2∶998，V/V）， 流動相B 相為乙腈。 二次純化液相色譜梯度洗脫程序： 0～2 min， 95%A、 5%B； 2～32 min，95% A→40% A、 5% B→60% B； 32～33 min，40% A→5% A、 60% B→95% B； 33 ～36 min，5% A、 95% B； 36 ～37 min， 5% A →95% A、95%B→5%B； 37～40 min， 95%A、 5% B。 其他條件保持不變， 獲得蜂毒肽純品。

蜂毒肽純度測定液相色譜條件： 色譜柱為Athena C18-BIO （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相A 相為三氟乙酸-水 （2∶998，V/V）； 流動相B 相為甲醇。 梯度洗脫程序： 0～40 min， 28%A、72%B。 流速1 mL/min， 進樣量10 μL， 洗脫時間40 min。 紫外檢測器波長214 nm。

2. MALDI-TOF-MS 定性分析。 采用80%乙腈水分別配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的α-氰基-4-羥基肉桂酸 （CHCA） 基質(zhì)溶液和1 mg/mL 的蜂毒肽溶液， 分別取1 μL 混合于MALDI 樣品板上， 使用線性正離子模式進行MS 分析， 掃描范圍為400～4 000 Da （15 000 次發(fā)射， 激光強度為90個任意單位）。

3. 氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法。 樣品前處理： 用高精密天平準確稱量1 mg 蜂毒肽， 準確加入999 mg 純凈水， 混勻。

異亮氨酸標記物工作液配制： 準確稱取異亮氨酸標記物2.794 mg （精確到0.001 mg）， 加入19 809.94 mg （精確到0.1 mg） 0.1mol/L 鹽酸水溶液中， 充分振搖棕色玻璃瓶使其溶解后用安瓿瓶進行分裝， 于4℃冰箱中保存。

準確稱量50 mg 蜂毒肽水溶液及50 mg 異亮氨酸標記物工作液（濃度為0.138 2 mg/g）， 加入至干凈的安瓿瓶中， 混勻后加入1 mL 6 mol/L 鹽酸水溶液， 以1 000 r/min 混勻5 min。 將安瓿瓶放置在4℃冷水浴中持續(xù)吹入氮氣， 將氮氣流速調(diào)到能將復(fù)溶液液面輕微吹動， 保持50 s， 立即將安瓿瓶熱熔封。 熔封后的樣品在110℃的烘箱下水解48 h，水解完成后， 取出樣品放置在40℃的水浴中氮吹干燥， 用1mL 0.1 mol/L HCl 復(fù)溶樣品， 以1 000 r/min 混勻20 min， 用0.22 μm 低吸附蛋白濾膜過濾， 上機分析。

色譜條件： KINETEX C18色譜柱； 流動相為甲酸乙腈水 （2-20-978，V/V/V）； 等度洗脫； 流速為0.2 mL/min； 進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件： 電噴霧正離子 （ESI+） 監(jiān)測模式；多反應(yīng)檢測掃描 （MRM） 模式； 離子源噴射電壓為5 500 V； 離子源溫度為550℃； 霧化器壓力（GS1） 為379.21 kPa； 輔 助 氣 壓 力 （GS2） 為379.21 kPa； 氣簾氣壓力 （CUR） 為241.32 kPa；離子駐留時間為100 ms。 MRM 監(jiān)測離子對信息為異亮氨酸（132.1>86.2）、 異亮氨酸標記物 （142.1>96.2）。

4. 結(jié)果計算。 質(zhì)譜分析后， 采用氨基酸標準溶液單點校準樣品中氨基酸測量結(jié)果， 并通過氨基酸的理論含量， 計算蜂毒肽含量。 計算公式為x＝（10.1×MSec×MMel×mL樣品×IL標準×IX樣品×mN標準）/［IN標準×IL樣品×mL標準×m樣品×MAA×（10.1×nMel×MSec+nSec×MMel）］。其中，x為樣品中蜂毒肽的純度 （g/g）；10.1 為樣品中蜂毒肽與鎮(zhèn)靜肽-2 （有機雜質(zhì)） 的液相純度（含量）比；MSec為鎮(zhèn)靜肽-2 的相對分子質(zhì)量；MMel為蜂毒肽的相對分子質(zhì)量；mL樣品為樣品溶液中標記的氨基酸的質(zhì)量 （μg）；IL標準為標準溶液中標記的氨基酸的峰面積；IX樣品為樣品溶液中氨基酸的峰面積；mN標準為標準溶液中氨基酸的質(zhì)量（μg）；IN標準為標準溶液中氨基酸的峰面積；IL樣品為樣品溶液中標記的氨基酸的峰面積；mL標準為標準溶液中標記的氨基酸的質(zhì)量（μg）；m樣品為樣品稱樣量 （μg）；MAA為該氨基酸的相對分子質(zhì)量；nMel為蜂毒肽中含有該氨基酸的個數(shù)；nSec為鎮(zhèn)靜肽-2 中含有該氨基酸的個數(shù)。

二、 結(jié)果與討論

（一） 蜂毒肽分離純化與定性分析 蜂毒凍干粉成分復(fù)雜， 含有多肽類、 酶類及不溶性物質(zhì)， 因此分離純化蜂毒肽難度較大， 尤其是理化性質(zhì)和相對分子質(zhì)量與蜂毒肽接近的多肽類物質(zhì)對其分離純化的純度影響較大。 根據(jù)已有研究[12～14]， 采用高效液相制備色譜分離純化蜂毒肽的效果較好。 因此，本研究以甲酸水-乙腈和三氟乙酸水-乙腈為流動相， 用反相C18半制備色譜柱對經(jīng)過超聲提取過濾后的蜂毒樣品溶液進行分離純化， 結(jié)果見圖1。 如圖1 所示， 經(jīng)過溶劑提取過濾后， 仍含有較多具有紫外吸收的雜質(zhì)。 當采用高效液相制備色譜法對蜂毒肽樣品溶液二次分離純化后， 純化效果顯著提升（見圖1）。 對比圖1 純化前后色譜圖可以發(fā)現(xiàn)， 具有紫外吸收的雜質(zhì)得到有效地去除， 但純化后蜂毒肽的色譜峰有拖尾現(xiàn)象， 為了考察是否存在結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)與主峰重疊， 進一步優(yōu)化了流動相種類、洗脫程序等色譜條件， 結(jié)果見圖2。 如圖2 所示，純化后的蜂毒肽樣品中存在一個響應(yīng)較高的雜質(zhì)，但該雜質(zhì)去除難度大， 回收率低， 且目前所得樣品的HPLC-UV 面積歸一化的純度為91%， 已滿足后續(xù)實驗要求。 經(jīng)計算， 一次純化后蜂毒肽粗品產(chǎn)率約為30.86%， 二次純化后， 蜂毒肽最終得率約為25.60%。

圖2 方法優(yōu)化后的蜂毒肽色譜圖

針對分離純化后的蜂毒肽樣品采用MALDITOF-MS 定性分析， 結(jié)果見圖3。 結(jié)果顯示， 2 846.87、1 423.90、 380.10 （m/z） 質(zhì)譜峰響應(yīng)顯著。 蜂毒肽的分子量為2 846Da， 分析可知m/z2 846.87 為蜂毒肽[M+H]+峰，m/z1 423.90 為蜂毒肽[M+2H]2+峰，m/z380.10 及其質(zhì)量范圍附近的碎片峰為CHCA基質(zhì)的質(zhì)譜峰。 因此， 認定樣品中主要成分為蜂毒肽。 同時， 也發(fā)現(xiàn)m/z2 873.89 處質(zhì)譜峰可能來自未除去雜質(zhì)的[M+H]+峰。

圖3 蜂毒肽樣品的MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖

為了進一步確認雜質(zhì)， 采用高分辨質(zhì)譜對樣品進行分析， 結(jié)果見圖4。 經(jīng)過分析認為m/z475.3、570.2、 712.4、 949.6 分別為蜂毒肽多電荷分子離子峰[M+6H]6+、 [M+5H]5+、 [M+4H]4+、 [M+3H]3+， 進一步確認了主要成分為蜂毒肽。 同時也檢出479.8、575.6、 719.2、 958.6（m/z）一系列質(zhì)譜峰， 經(jīng)推測分析， 其可能為圖3 中2 873.89 （m/z） 質(zhì)譜峰的多電荷分子離子峰[M+6H]6+、 [M+5H]5+、 [M+4H]4+、[M+3H]3+， 計算分析可知該雜質(zhì)相對分子質(zhì)量為2 872.9 Da。 同時檢出的279.2、 301.1 （m/z） 與溶劑對比， 分析認定為離心管或系統(tǒng)管路中存在的鄰苯二甲酸二叔丁酯及其鈉鹽。 通過與以往研究報道[18～19]比較， 認定蜂毒肽中的有機雜質(zhì)為含有25個氨基酸殘基的鎮(zhèn)靜肽-2 （YIIDVPPRCPPGSK FVHKRCRVIVP）。

圖4 蜂毒肽樣品中主要有機雜質(zhì)的高分辨質(zhì)譜圖

（二） 蜂毒肽水解成氨基酸的條件優(yōu)化 目前，氨基酸水解結(jié)合同位素稀釋質(zhì)譜法是蛋白質(zhì)、 多肽類物質(zhì)的高準確度定值主要方法。 氨基酸種類較多， 常用于定值的主要有脯氨酸、 纈氨酸、 亮氨酸、 異亮氨酸、 丙氨酸和苯丙氨酸[20～21]。 由蜂毒肽及鎮(zhèn)靜肽-2 的氨基酸序列可知， 兩者氨基酸數(shù)目相當， 且均含有3 個異亮氨酸。 利用異亮氨酸對兩者進行定量分析， 不僅能使測定值更加準確， 而且有典型代表性。

異亮氨酸能否充分水解對蜂毒肽準確測定非常關(guān)鍵， 通常水解液的濃度、 水解溫度和水解時間是對水解效率影響較大的3 個因素， 因此本研究重點從這3 個影響因素入手去優(yōu)化水解條件。 根據(jù)文獻報道[22～24]， 蛋白質(zhì)水解成氨基酸常用鹽酸作為水解液， 因此， 本研究選擇了鹽酸并分別考察了4、6、 8 mol/L 等濃度條件下的水解效率， 結(jié)果見圖5A。 如圖5A 所示， 當鹽酸濃度超過5 mol/L 后，水解效率趨于平衡， 當鹽酸濃度為8 mol/L 時， 水解效率下降， 蜂毒肽純度的計算結(jié)果偏低， 可能的原因是酸性過強， 異亮氨酸耐酸性較弱造成分解，因此確定鹽酸濃度為6 mol/L。 同時， 考察了110～130℃范圍內(nèi)的蜂毒肽的水解效率， 結(jié)果見圖5B。 從圖5B 中可以看出， 當溫度達到110℃后，水解效率已經(jīng)趨于平衡， 最終選擇110℃作為水解溫度。 此外， 考察了水解時間的影響， 結(jié)果見圖5C。 結(jié)果顯示， 水解48 h 后水解效率達到最高且不再變化， 因此認為48 h 可作為蜂毒肽中異亮氨酸充分水解的時間條件。

圖5 鹽酸濃度 （A）、 水解溫度 （B） 和水解時間 （C）對蜂毒肽樣品中異亮氨酸水解效率的影響

（三） 蜂毒肽定值 稱取一定量分離純化后的蜂毒肽凍干樣品， 根據(jù)上述優(yōu)化確定的異亮氨酸水解條件進行前處理， 平行測定5 個樣品， 將樣品與異亮氨酸標準溶液上機分析。 圖6A 與圖6B 分別是異亮氨酸標準溶液與樣品水解后異亮氨酸的LC-MS/MS 譜圖。 將色譜圖得到的峰面積， 根據(jù)公式計算得出蜂毒肽含量測定結(jié)果分別為65.97%、65.81%、 66.09%、 66.45%、 66.40%， 以平均值±標準偏差形式表示為66.14%±0.27% （n＝5）。 由結(jié)果推測影響蜂毒肽純度的除了鎮(zhèn)靜肽-2 外， 分離純化過程中引入的有機溶劑、 水分以及難揮發(fā)性酸可能也是主要影響因素。

圖6 標準溶液（A） 與蜂毒肽水解成氨基酸的樣品（B） 中異亮氨酸及其同位素內(nèi)標的LC-MS/MS 質(zhì)譜圖

為確證氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法測定結(jié)果， 也采用質(zhì)量平衡法測定了蜂毒肽純度， 純度計算公式為P＝Po× （100%-Xw-Xn-Xv） × 100%。其中，Po指高效液相色譜法測得的蜂毒肽主成分的峰面積百分比；Xw為水分含量 （%）；Xn為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測得的無機非揮發(fā)性雜質(zhì)含量（%）；Xv為頂空氣相色譜法測得的有機揮發(fā)性雜質(zhì)含量（%）。

應(yīng)用前期研究確定的液相色譜法對蜂毒肽主成分及其有機雜質(zhì)進行測定， 結(jié)果顯示， 蜂毒肽面積歸一化結(jié)果為91.2%， 主要有機雜質(zhì)鎮(zhèn)靜肽-2 為8.8%。 由于純化過程使用了水作為流動相， 因此水分含量的準確測定對于定值結(jié)果準確非常關(guān)鍵。本研究重點采用熱重分析（TGA） 對凍干后的蜂毒肽樣品中殘留水分含量進行了測定， 水分含量結(jié)果為7.47%。 由于凍干過程三氟乙酸不容易去除， 且其與堿性氨基酸易結(jié)合， 因此本研究采用離子色譜測定了三氟乙酸根的含量， 結(jié)果為16.7%。 此外，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜和頂空氣相色譜法分別測定了蜂毒肽樣品中無機元素含量和揮發(fā)性溶劑殘留， 測得總無機元素質(zhì)量分數(shù)為0.96%， 揮發(fā)性溶劑殘留未檢出。 綜上所述， 采用質(zhì)量平衡法對蜂毒肽樣品定值的結(jié)果為68.26%±0.51%（n＝6， 見表1）。

表1 質(zhì)量平衡法測定蜂毒肽含量的結(jié)果 （n＝6， %）

由此可見， 兩種不同原理方法的定值結(jié)果一致性較好， 采用氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法測定的結(jié)果準確可靠。 將蜂毒肽純度定值的結(jié)果取兩種不同原理方法測定結(jié)果的平均值， 即蜂毒肽純度為67.2%。 同時， 質(zhì)量平衡法的測定數(shù)據(jù)也證明了有機雜質(zhì)鎮(zhèn)靜肽-2、 水分、 三氟乙酸是影響蜂毒肽純度進一步提升的主要因素， 今后的研究重點將圍繞這3 種物質(zhì)的去除開展。

三、 結(jié)論

本研究開展了蜂毒中蜂毒肽分離純化的研究，并采用氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法對純化后的蜂毒肽樣品進行了純度準確測定， 將測定結(jié)果與經(jīng)典的質(zhì)量平衡法測定結(jié)果進行比較驗證。 結(jié)果顯示，氨基酸水解同位素稀釋質(zhì)譜法測定蜂毒肽的純度為66.14%±0.27%， 質(zhì)量平衡法測定結(jié)果為68.26%±0.51%， 兩種不同原理方法的測定結(jié)果一致性較好， 最終確定蜂毒肽純度為67.2%。 同時， 對鎮(zhèn)靜肽-2、 水分、 三氟乙酸等影響純度提升的主要雜質(zhì)進行了確證與定量測定， 為下一步純度的提升提供了參考， 也為蜂毒肽在化妝品、 保健食品中的有效利用提供了技術(shù)支撐。