超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中地西泮、甲硝唑和地美硝唑殘留量

陳桂芳 倪建秀 丁春暉 張文慧 冒維維 李文杰

（南京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測院， 南京210046）

地西泮， 又名安定， 是一種典型的苯二氮卓類長效鎮(zhèn)定劑， 具有抗焦慮、 鎮(zhèn)靜、 催眠、 抗癲癇及中樞性肌肉松弛等作用[1～4]。 甲硝唑和地美硝唑，屬硝基咪唑類抗菌藥物， 對厭氧菌及原蟲有獨特的殺滅作用， 具有潛在的致癌、 致畸、 致突變作用和遺傳毒性[5～7]。 地西泮、 甲硝唑和地美硝唑在我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》 中均被規(guī)定為允許作治療用， 但不得在動物性食品中檢出的獸藥。 近年來， 動物性食品中獸藥殘留事件頻出， 曾在淡水魚中檢出地西泮[8]， 在雞蛋、 雞肉、 鴿子、 桂花魚、多寶魚等食品中檢出甲硝唑[9～13]。 這些獸藥在動物體內(nèi)殘留后可通過食物鏈進入人體， 當(dāng)人體內(nèi)蓄積的藥物濃度達到一定量時會產(chǎn)生耐藥性和加重肝臟負擔(dān)等問題， 威脅人體健康。

目前， 水產(chǎn)品中同時測定地西泮、 甲硝唑和地美硝唑殘留的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法較少， SN/T 3235-2012 《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/ 質(zhì)譜法》 中提取液較復(fù)雜， 水產(chǎn)品基質(zhì)僅為魚肉， 在應(yīng)用上有一定局限性。 另外， 該標(biāo)準(zhǔn)檢測方法未使用目標(biāo)物的同位素內(nèi)標(biāo)定量， 可能在一定程度上會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究在參考SN/T 3235-2012、 張秋云等[14]、徐媛原等[15]方法的基礎(chǔ)上， 擬以魚、 蝦、 蟹為基質(zhì)， 建立一種以內(nèi)標(biāo)法為基礎(chǔ)且能同時測定地西泮、 地美硝唑、 甲硝唑殘留量的方法， 并對樣品前處理方法和儀器分析條件進行優(yōu)化， 以期為水產(chǎn)品養(yǎng)殖或運輸環(huán)節(jié)中地西泮、 甲硝唑和地美硝唑藥物殘留監(jiān)測和風(fēng)險評估提供有效的技術(shù)手段。

一、 材料與方法

（一） 儀器與試驗材料

1.主要儀器。 6460C 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀［配有電噴霧離子源（ESI）， 美國Agilent 公司］； Avanti J-E 高效離心機 （美 國Beckman Coulter 公司）； KS 501 振蕩器（德國IKA公司）； MV5 全自動濃縮儀 （美國Lab Tech 公司）； Advantage A10 超純水儀 （美國Merck 公司）。

2. 材料與試劑。 地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑液體標(biāo)準(zhǔn)品， 地西泮-D5、 甲硝唑-D4、 地美硝唑-D3同位素內(nèi)標(biāo) （濃度為100 μg/mL， 天津阿爾塔科技有限公司）； 中性氧化鋁固相萃取柱 （1 g/3 mL， 美國SIGMA-ALDRICH 公司）； Oasis PRiME HLB 固相萃取柱 （500 mg/6 mL， 美國Waters 公司）； 0.45 μm GHP 萬用膜針式過濾器 （美國Pall公司）； 乙腈、 正己烷（色譜純， 美國Tedia 公司）；甲醇 （質(zhì)譜級， 美國Merck 公司）； 甲酸 （色譜純， 上海安譜實驗科技股份有限公司）； 乙酸銨（色譜純， 美國Merck 公司）； 試驗用水為超純水。

3. 樣品。 采集市售的鯽魚、 青蝦和中華絨螯蟹等水產(chǎn)品。

（二） 試驗方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。 準(zhǔn)確吸取地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑液體標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)體積， 用甲醇配制成100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。 準(zhǔn)確吸取地西泮-D5、 甲硝唑-D4、 地美硝唑-D3同位素內(nèi)標(biāo)相應(yīng)體積， 用甲醇配制成100 ng/mL 的混合內(nèi)標(biāo)工作液，置于-20 ℃保存。

2. 樣品前處理。 （1） 試樣的制備。 參照GB/T 30891-2014 《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》。 鯽魚樣品： 至少取3 尾鯽魚清洗后， 去頭、 骨、 內(nèi)臟， 取肌肉、 魚皮等可食部分絞碎混合均勻。 青蝦樣品： 至少取10 尾青蝦清洗后， 去蝦頭、 蝦皮、 腸腺， 得到整條蝦肉絞碎混合均勻。 中華絨螯蟹樣品： 至少取5只中華絨螯蟹清洗后， 取可食部分絞碎混合均勻。試樣量為400 g， 分為兩份， 其中一份用于檢驗，另一份留樣， 置于-20℃保存。 （2） 提取。 稱取樣品2.00 g （精確至0.01 g） 于50 mL 聚丙烯離心管中， 加入100 ng/mL 混合內(nèi)標(biāo)工作液50 μL， 渦旋混合30 s， 靜置10 min。 加入10 mL 乙腈， 渦旋30 s， 置于振蕩器中振蕩10 min， 在8 000 r/min、20℃離心5 min， 待凈化。 （3） 凈化。 取上清液過PRiME HLB 固相萃取柱， 收集流出液于10 mL 離心管中， 40℃下氮氣吹至近干。 加入1.0 mL 20%甲醇水溶液 （含0.1%甲酸） 復(fù)溶， 過0.45 μm 微孔濾膜， 待測。

3.液相色譜條件。 色譜柱： Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm）。 流動相： A 相為0.1%甲酸水， B 相為甲醇。 梯度洗脫條件： 0～3 min， 80%A→30%A； 3～9 min， 30%A→10%A；9～11 min， 10%A； 11～11.01 min， 10%A→80%A。流速0.25 mL/min； 柱溫40℃； 進樣量20 μL。

4. 質(zhì)譜條件。 電噴霧離子源： 正離子模式。霧化氣： 氮氣。 離子噴霧電壓： 4 000 V。 干燥氣溫度： 350℃。 干燥氣流速： 11 L/min。 霧化氣壓力： 310.26 kPa。 掃描方式： 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。離子對、 質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑MRM 質(zhì)譜參數(shù)

5. 數(shù)據(jù)處理。 采用Origin 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理， 分析檢出限、 定量限、 準(zhǔn)確度和精密度。

二、 結(jié)果與討論

（一） 色譜條件的優(yōu)化 本研究參照張秋云等[14]、 方力等[16]建立的檢測方法， 選用甲醇作為強洗脫流動相， 分別考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液 （含0.1%甲酸）、 甲醇-水3 種流動相條件對目標(biāo)化合物的靈敏度和峰形的影響。 結(jié)果顯示， 利用甲醇-0.1%甲酸水溶液、 甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液 （含0.1%甲酸）作流動相時， 目標(biāo)化合物的響應(yīng)值和峰形均好于甲醇-水作流動相， 在甲醇-0.1%甲酸水溶液中甲硝唑和地美硝唑響應(yīng)略高， 而在甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液 （含0.1%甲酸） 中地西泮響應(yīng)略高。 由于流動相中鹽對儀器有一定損傷， 經(jīng)綜合考慮， 選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

（二） 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 地西泮、 甲硝唑和地美硝唑和相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物易與氫離子結(jié)合成帶正電荷的準(zhǔn)分子離子[M+H]+。 因此， 在正離子模式下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀， 在m/z為50～450 的范圍內(nèi)進行一級質(zhì)譜全掃描（Scan）， 以確定母離子，選擇離子掃描 （SIM） 確定毛細管電壓， 然后進行子離子掃描， 選取豐度高且相對穩(wěn)定的2 個碎片離子分別作為定量離子和定性離子， 其中內(nèi)標(biāo)化合物只選取1 個離子。 最后， 以多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM）方法手動方式優(yōu)化定量和定性離子的碰撞能量， 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。 目標(biāo)化合物產(chǎn)生1 個前體離子和2 個產(chǎn)物離子， 得到4 個鑒別點， 符合歐盟委員會執(zhí)行條例 （EU） 2021/808 關(guān)于化合物確證鑒別點數(shù)的要求[17]。 各目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的MRM 特征離子色譜圖見圖1。

圖1 地西泮 （A）、 甲硝唑 （B）、 地美硝唑 （C）、 地西泮-D5 （D）、 甲硝唑-D4 （E）、 地美硝唑-D3 （F） 的MRM 特征離子色譜圖

（三） 樣品提取劑的優(yōu)化 地西泮、 甲硝唑和地美硝唑極性較弱， 易溶于乙酸乙酯[16，18～19]、 甲醇、乙腈[14～15，20]， 本研究選擇常用提取劑乙腈[21]。 以空白鯽魚樣品為基質(zhì)， 在1.0 μg/kg 加標(biāo)水平下， 考察了乙腈、 0.2%甲酸乙腈、 1%甲酸乙腈3 種提取劑對目標(biāo)化合物提取效果的影響。 結(jié)果顯示， 目標(biāo)化合物平均回收率均在93%～102%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)， 說明3 種提取劑對目標(biāo)化合物的提取效果相差不大。 乙腈能使水產(chǎn)品中的大量蛋白質(zhì)沉淀， 后續(xù)處理簡便， 目標(biāo)化合物回收率高， 因此選擇乙腈作為目標(biāo)化合物的提取劑。

（四） 凈化方法的優(yōu)化 中華絨螯蟹基質(zhì)相對復(fù)雜， 以空白中華絨螯蟹樣品為基質(zhì)， 在1.0 μg/kg 加標(biāo)水平下， 考察了中性氧化鋁固相萃取小柱、 PRiME HLB 固相萃取小柱和正己烷凈化等3種常見動物源食品基質(zhì)凈化方法對目標(biāo)化合物回收率的影響[22]。 結(jié)果顯示， 加標(biāo)樣品經(jīng)正己烷凈化后， 得到的總離子流圖在6.538 min 處出現(xiàn)雜質(zhì)峰，且雜質(zhì)峰響應(yīng)強度高于地美硝唑響應(yīng)強度 （見圖2A）， 而經(jīng)中性氧化鋁固相萃取小柱、 PRiME HLB固相萃取小柱凈化后， 得到的加標(biāo)樣品總離子流圖中雜質(zhì)峰響應(yīng)強度低于地美硝唑響應(yīng)強度 （見圖2B）。 同時， 樣品經(jīng)正己烷凈化后甲硝唑回收率高于120%， 而經(jīng)中性氧化鋁固相萃取小柱、 PRiME HLB 固相萃取小柱凈化后的回收率無顯著差異（見圖3）。 與正己烷相比， 固相萃取小柱具有更好的凈化效果， PRiME HLB 固相萃取柱可以有效去除大部分脂肪、 磷脂等基質(zhì)干擾物。 綜上所述， 本研究選用PRiME HLB 固相萃取小柱凈化。

圖2 不同凈化方法下的中華絨螯蟹加標(biāo)樣品總離子流圖

圖3 不同凈化方法對目標(biāo)化合物回收率的影響

（五） 基質(zhì)效應(yīng)研究 將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別用UPLC-MS/MS 測定， 按照濃度比和相應(yīng)的峰面積比繪制線性方程，計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）。 基質(zhì)效應(yīng)按公式“ME＝（Sm/Ss-1） ×100” 進行計算， 其中，Sm和Ss分別表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。 當(dāng)結(jié)果為負值時表示基質(zhì)抑制效應(yīng)， 結(jié)果為正值時表示基質(zhì)增強效應(yīng)。 當(dāng)ME 為-20%～20%時為弱基質(zhì)效應(yīng)； ME 為-50%～-20%或20%～50%時為中等基質(zhì)效應(yīng)； 當(dāng)ME<-50%或>50%時為強基質(zhì)效應(yīng)[23]。結(jié)果顯示， 地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑在鯽魚基質(zhì)中的ME 分別為8%、 19%、 1%， 在青蝦基質(zhì)中的ME 分別為5%、 4%、 5%， 在中華絨螯蟹中的ME 分別為11%、 7%、 2%， 均在0～20%之間（見圖4）， 表現(xiàn)為弱基質(zhì)增強效應(yīng)。 這說明同位素內(nèi)標(biāo)法定量在樣品前處理和離子化過程中可以較好地抵消基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響， 因此， 本研究采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液對藥物殘留進行定量。

圖4 不同水產(chǎn)品中地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑的基質(zhì)效應(yīng)

（六） 方法的線性范圍和檢出限 分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)工作液適量， 用20%甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 2.0、5.0、 10.0、 20.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 其中各標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為5.0 ng/mL。 以目標(biāo)化合物的相對響應(yīng)值 （目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比） 為縱坐標(biāo)， 相對濃度（目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)的濃度比） 為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 采用基質(zhì)加標(biāo)的方式確定方法檢出限和定量限。 結(jié)果表明， 3 種目標(biāo)化合物在質(zhì)量濃度為0.5～20.0 ng/mL 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系 （見表2）， 相關(guān)系數(shù)均大于0.99， 檢出限均為0.1 μg/kg （信噪比>3）， 定量限均為0.5 μg/kg （信噪比>10）。

表2 地西泮、 甲硝唑、 地美硝唑的線性方程及相關(guān)系數(shù)

（七） 質(zhì)控樣的回收率和精密度 取空白試樣進行加標(biāo)和精密度實驗， 加標(biāo)水平為0.5、 1.0、 5.0 μg/kg， 每個水平重復(fù)測定6 次。 地西泮、 甲硝唑和地美硝唑在3 種水產(chǎn)品基質(zhì)中的平均回收率和精密度結(jié)果見表3。 加同位素內(nèi)標(biāo)的空白基質(zhì)提取離子流圖見圖5。 結(jié)果顯示， 鯽魚中3 種藥物的平均回收率為90.9%～105.7%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～9.7%； 青蝦中3 種藥物的平均回收率為85.3%～105.8%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～11.2%； 中華絨螯蟹中3 種藥物的平均回收率為93.6%～118.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～10.8%。 回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008 《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》 的技術(shù)要求。

圖5 鯽魚 （A）、 青蝦 （B）、 中華絨螯蟹 （C） 空白基質(zhì)提取離子流圖

表3 空白基質(zhì)中添加3 種藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝6）

（八） 實際樣品檢測 應(yīng)用本研究建立的檢測方法對20 批次不同種類水產(chǎn)品進行檢測， 將檢測結(jié)果與采用SN/T 3235-2012 標(biāo)準(zhǔn)檢測方法獲得的檢測結(jié)果進行比對。 結(jié)果顯示， 采用本方法和SN/T 3235-2012 標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測到同一批次鳙魚樣品存在地西泮殘留， 殘留量檢測結(jié)果分別為0.37 μg/kg 和0.38 μg/kg。 經(jīng)t檢驗發(fā)現(xiàn)，P值為0.3 （P>0.05）， 表 明 本 方 法 檢 測 結(jié) 果 與SN/T 3235-2012 標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的檢測結(jié)果無顯著差異。檢出樣品的提取離子色譜圖見圖6。

圖6 鳙魚中地西泮的提取離子色譜圖

三、 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS 同時測定水產(chǎn)品中地西泮、 甲硝唑和地美硝唑殘留量的方法， 并對色譜條件、 質(zhì)譜條件、 樣品提取劑和凈化方法進行了優(yōu)化， 優(yōu)化后的方法采用目標(biāo)物的同位素內(nèi)標(biāo)進行定量， 有效抑制了基質(zhì)效應(yīng)， 提高了檢測準(zhǔn)確性。 本方法操作簡單， 可滿足同時檢測水產(chǎn)品中地西泮、 甲硝唑和地美硝唑殘留的要求， 也為其他動物源食品基質(zhì)中相關(guān)藥物殘留的檢測技術(shù)研發(fā)提供了思路。