高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定大豆中的6 種硒形態(tài)

王賢波 聶 晶 翁麗萍 張 樂 袁玉偉 余繼忠

（1. 杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院實驗中心， 杭州310024； 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州310021）

硒（Se） 是人體必需的微量元素之一， 被譽為“生命火種” 和“心臟的守護神”， 也是谷胱甘肽過氧化酶活性中心的重要組成部分， 具有抗氧化、 清除自由基、 抗癌防癌、 提高免疫力等功能[1]。 但是， 攝入過量的硒會引起食物中毒[2]。 硒的化學形態(tài)是影響硒的生物有效性以及毒性的重要因素[3～4]。食品中硒具有多種化學形態(tài)， 主要分為無機硒和有機硒。 無機硒主要為亞硒酸根和硒酸根， 其毒性較大， 利用率不理想， 生物有效性低， 被嚴格限制使用量[5]。 有機硒如硒蛋白、 硒多糖等在抗菌、 抗病毒、 抗腫瘤， 以及調(diào)節(jié)免疫力、 保護心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等方面有一定的作用[6～9]。 因此， 食品中硒元素的形態(tài)分析對食品安全監(jiān)管與控制、 食物營養(yǎng)價值評價具有至關重要的意義， 也是目前國際上食品化學分析領域的一個重要研究熱點。

大豆是我國主要經(jīng)濟作物之一， 也是一種富硒食物。 統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明， 糧食谷物中硒含量在0.1～0.8 mg/kg， 而富硒地區(qū)大豆中硒含量可高達8 mg/kg[10]。建立簡單快速準確的測定方法， 分析大豆中硒的形態(tài)對保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全具有重要意義。 現(xiàn)階段， 農(nóng)產(chǎn)品中不同硒形態(tài)的分析主要包括前處理提取和檢測分析兩個方面， 常用提取方法主要有水-超聲提取[11]、 水-酶-超聲提取[12]、 水-酶-振蕩提取[10]、 緩沖液-酶-振蕩提取[13]、 水-酶-微波提取[14]等。 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ICP-MS） 技術具有準確性強、 靈敏度高、 線性范圍寬等優(yōu)點， 在元素形態(tài)分析中得到廣泛應用[15～19]。 大豆硒形態(tài)的分析方法較少， 在已有的文獻報道中， 存在檢測限高、 提取時間長等不足[10，19～20]。 本研究擬采用超聲輔助酶水解的前處理方法， 并通過試驗和條件優(yōu)化， 建立HPLC-ICPMS 檢測大豆中6 種硒形態(tài)的方法， 以期為富硒食品中硒形態(tài)的分析提供更多的參考。

一、 材料與方法

（一） 儀器 Xseries2 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 （美國賽默飛世爾科技公司）； U3000 型高效液相色譜儀（美國戴安公司）； Express 型微波消解儀（美國CEM 公司）； GM 200 型刀式研磨儀 （德國萊馳公司）； BHW-09C 型恒溫趕酸儀 （上海博通化學科技有限公司）； Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（德國默克公司）。

（二） 試劑與材料 硝酸 （優(yōu)級純， 美國賽默飛世爾科技公司）； 甲醇、 甲酸 （色譜純， 美國賽默飛世爾科技公司）； 磷酸氫二銨 （色譜純， 美國Sigma 公司）； 四丁基溴化銨 （分析純， 國藥集團）； 氨水（分析純， 美國Sigma 公司）； 蛋白酶E（7 000 U/g， 北京索萊寶科技有限公司）； 蛋白酶XIV （≥3.5 U/mg， 上海安譜實驗科技股份有限公司）； 蛋白酶K （40.5 U/mg， 德國默克公司）；Athena C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm， 上海安譜實驗科技股份有限公司）； Hamilton PRPX100 色譜柱 （4.1 mm×250 mm， 10 μm， 瑞士Hamilton 公司）。 所有玻璃儀器均用硝酸溶液（20%） 浸泡24 h 以上， 用超純水沖洗干凈， 烘干備用。

（三） 樣品與標準物質(zhì) 試驗樣品： 選取市售大豆。 標準物質(zhì)： 硒標準溶液 （1 000 μg/mL，GSB 04-1751-2004， 國家標準物質(zhì)中心）； 硒代半胱氨酸（SeCys）（純度≥98%， 湖北萬得化工有限公司）； 硒代乙硫氨酸（SeEt）（純度≥98%， 加拿大TRC 公司）； 甲基-硒代半胱氨酸 （MeSeCys） 標準溶液 （34.8 μg/g， 以硒計， 中國計量科學研究院）； 硒代蛋氨酸 （SeMet） 標準溶液 （39.4 μg/g，以硒計， 中國計量科學研究院）； 硒酸根 （Se（VI）） 標準溶液（41.5 μg/g， 以硒計， 中國計量科學研究院）； 亞硒酸根 （Se （IV）） 標準溶液 （42.9 μg/g， 以硒計， 中國計量科學研究院）。

（四） 樣品制備 大豆樣品研磨成粉末后， 過100 目篩， 裝入潔凈的盛樣袋內(nèi)， 密封并儲存在冷凍室里待用。

（五） 樣品前處理 微波消解總硒： 稱取0.50 g 樣品于消解罐中， 加入6 mL 硝酸， 然后蓋好安全閥， 將消解罐放入微波消解儀中消解。 將消解完全的消化液于120 ℃趕酸至氮氧化物散盡， 冷卻并轉移到25 mL 容量瓶中， 用超純水少量、 多次洗滌罐內(nèi)壁和罐蓋， 合并洗液于容量瓶中， 定容， 混勻待測。 同樣方法做試劑空白試驗。

超聲輔助酶提取硒形態(tài)： 稱取0.10 g 樣品于50 mL 離心管中， 加入10 mg 蛋白酶E 和10 mL 超純水， 于37℃超聲提取30 min， 以8 000 r/min 離心15 min 后取上清液。 沉淀物依照以上的酶解條件再次酶解離心后取上清液。 將上清液合并， 定容到25 mL 容量瓶中， 過0.22 μm 水性濾膜后上機測定。

（六） 儀器條件 HPLC 工作條件： Athena C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； Athena 保護柱（4.0 mm×20 mm， 5 μm）； 流動相為2.0 mmol/L 四丁基溴化銨-30.0 mmol/L 磷酸氫二銨-2.0%甲醇（pH 7.4）； 流速1.0 mL/min； 進樣體積100 μL； 柱溫25℃； 等度洗脫。

ICP-MS 工作條件： 射頻功率1 300 W； 霧化氣流速0.91 L/min； H2-He 碰撞氣流速6.3 mL/min；冷卻氣流速13.0 L/min； 模擬電壓2 200 V； 脈沖電壓3 440 V； 鉑金錐。

二、 結果與討論

（一） 色譜分離條件的優(yōu)化

1. 色譜峰的定性和定量。 硒在自然界中存在6種同位素， 包括74Se、76Se、77Se、78Se、80Se 和82Se，各同位素的自然豐度分別為0.89%、 9.37%、7.63%、 23.77%、 49.61%和8.73%。80Se 的自然豐度最高， 但在質(zhì)譜中受到40Ar40Ar+干擾也最大。 因此， 選擇自然豐度較高的78Se 作為定量離子， 并采用雙路氣體 （H2-He） 碰撞反應池模式， 以消除40Ar38Ar+與38Ar40Ca+等對78Se 的質(zhì)譜干擾。 根據(jù)單個硒形態(tài)標準溶液的保留時間， 判斷各物質(zhì)的出峰順序依次為SeCys、 MeSeCys、 Se （IV）、 SeMet、Se （VI） 和SeEt[16]。

2.色譜柱的選擇。 本研究比較了Hamilton PRP-X100 陰離子交換柱和Athena C18柱的分離效果， 結果表明， 以5 mmol/L 的檸檬酸銨-1%甲醇（pH 4.3） 為流動相， PRP-X100 陰離子交換柱對SeEt 的分離效果較差； 以2.0 mmol/L 四丁基溴化銨-30.0 mmol/L 磷酸氫二銨-2.0%甲醇 （pH 7.4）為流動相， Athena C18柱能在14 min 內(nèi)實現(xiàn)6 種硒形態(tài)的完全分離， 峰形尖銳對稱 （見圖1）。 因此，本研究采用Athena C18柱作為分離色譜柱。

圖1 Athena C18 色譜柱條件下6 種硒形態(tài)色譜圖

3. 流動相pH 對不同形態(tài)硒分離效果的影響。流動相pH 是影響具有不同pKa值元素形態(tài)分離的主要因素。 在不同的酸度條件下， 硒將以不同形態(tài)存在 （陽離子、 陰離子或者兩性離子）， 因此不同pH 的流動相對各硒形態(tài)的分離效果會產(chǎn)生較大影響[21]。 以2.0 mmol/L 四丁基溴化銨、 30.0 mmol/L磷酸氫二銨和2.0%甲醇為流動相， 用甲酸或氨水調(diào)節(jié)流動相pH， 不同的流動相pH 下各種硒形態(tài)的峰面積變化情況見圖2A。 6 種硒形態(tài)峰面積均在pH 7.4 時到達最大值， 且結合色譜分離的譜圖發(fā)現(xiàn)pH 變化對SeCys、 MeSeCys、 Se （IV） 的分離影響較大， pH 在7.0～7.3 時， SeCys 分離度較差；當pH＞7.5 時， MeSeCys 和Se （IV） 分離較差。 綜合考慮以上因素， 本研究將流動相pH 定為7.4。

圖2 不同色譜分離條件對6 種硒形態(tài)峰面積的影響

4. 離子對濃度對不同硒形態(tài)分離效果的影響。以30.0 mmol/L 磷酸氫二銨、 2.0%甲醇為流動相，用甲酸或氨水調(diào)節(jié)流動相pH 至7.4， 在流動相中添加0.5～3.0 mmol/L 濃度范圍的離子對試劑四丁基溴化銨， 考察了離子對濃度對6 種硒形態(tài)峰面積的影響， 結果見圖2B。 在離子對濃度為0.5～1.0 mmol/L 時， 6 種硒形態(tài)峰面積略微下降， 在2.0 mmol/L 達到峰值， 隨后又下降。 通過譜圖的觀察，離子對濃度為0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L 時，MeSeCys 和Se （IV） 不能完全分離， 而離子對濃度為3.0 mmol/L 時， MeSeCys 分離度較差。 結合峰面積和分離效果， 本研究離子對濃度采用2.0 mmol/L 較為合適。

5. 緩沖鹽濃度對不同硒形態(tài)分離效果的影響。以2.0 mmol/L 四丁基溴化銨、 2.0%甲醇為流動相，用甲酸調(diào)節(jié)流動相pH 至7.4， 在流動相中添加10.0～40.0 mmol/L 濃度范圍的緩沖鹽磷酸氫二銨，考察了緩沖鹽濃度對6 種硒形態(tài)峰面積的影響， 結果見圖2C。 各硒形態(tài)的峰面積隨緩沖鹽濃度的變化情況有所差異， 當緩沖鹽濃度為10.0～20.0 mmol/L 時， Se （VI） 峰面積陡然增加， MeSeCys和Se （IV） 峰面積明顯增加， SeMet 和SeEt 峰面積略微下降， SeCys 峰面積幾乎沒有變化， 從色譜分離圖也可看出緩沖鹽濃度在10.0 mmol/L 時，Se （VI） 幾乎沒有分離； 當緩沖鹽濃度為20.0～30.0 mmol/L 時， 除了MeSeCys 峰面積幾乎保持不變外， 其他硒形態(tài)的峰面積略微上升， 并在30.0 mmol/L 達到峰值， 各硒形態(tài)的峰完全分離； 當緩沖鹽濃度大于30.0 mmol/L 后， 在40.0 mmol/L 時MeSeCys 和Se （IV） 分離效果不佳。 綜上所述，本研究緩沖鹽濃度采用30.0 mmol/L 較為合適。

6.甲醇濃度對不同形態(tài)硒分離效果的影響。 本研究還考察了流動相中加入甲醇 （濃度范圍為0～2.0%） 對6 種硒形態(tài)的增敏作用及分離效果的影響， 結果見圖3。 結果表明， 流動相中加入甲醇增加了各硒形態(tài)信號強度， 且在該范圍內(nèi)隨甲醇濃度升高而增大。 此外， 甲醇濃度升高縮短了SeEt 的出峰時間。 由于甲醇濃度過高會在ICP-MS 采樣錐上產(chǎn)生碳富集堵塞錐孔， 需時常清洗[16]。 因此，本研究選擇甲醇濃度為2.0%， 既可以增加硒的靈敏度又可以減少采樣錐上的碳富集。

圖3 不同甲醇濃度條件下6 種硒形態(tài)色譜圖

（二） 前處理提取條件的優(yōu)化

1.蛋白酶種類的選擇。 目前， 酶提取是植物硒蛋白中有機硒的有效提取方法。 不同種類的蛋白酶對不同樣品中的硒提取存在差異， 楊修斌等[10]利用蛋白酶K 水溶液于37℃恒溫水浴振蕩提取了美國進口轉基因大豆中的5 種硒形態(tài)； 曾鳳澤和姚宇澤[14]利用微波輔助蛋白酶XIV 提取了靈芝中的6 種硒形態(tài)； 魏琴芳等[19]利用蛋白酶E 水溶液于37℃超聲提取了大豆中的5 種硒形態(tài)。 本研究在超聲輔助蛋白酶水解的條件下考察了不同種類酶處理對6 種硒形態(tài)的提取影響。 對比試驗在0.100 g 樣品中加入10 mg 不同種類蛋白酶和10 mL 超純水， 于37℃（蛋白酶K 采用58℃） 超聲提取2 次， 每次30 min。 不同蛋白酶 （蛋白酶E、 蛋白酶XIV、 蛋白酶K） 對大豆中硒形態(tài)提取效率的影響結果見圖4A。 結果表明， 3 種蛋白酶的提取效率存在顯著差異， 蛋白酶E 的提取效率最高， 蛋白酶XIV 的提取效率次之， 蛋白酶K 的提取效率在上述兩者之后， 故本研究選擇加入蛋白酶E。

圖4 不同提取條件對大豆中硒形態(tài)提取效率的影響 （n＝3）

2. 蛋白酶用量的優(yōu)化。 蛋白酶的用量也會直接影響硒形態(tài)的提取效率。 對比試驗在0.100 g 樣品中分別加入不同量的蛋白酶E 和10 mL 超純水，于37℃超聲提取2 次， 每次30 min， 考察了蛋白酶用量對大豆中硒形態(tài)提取效率的影響， 結果見圖4B。 結果表明， 10 mg 的加酶量就能達到較好的提取效果， 且與其他加入的蛋白酶量呈顯著差異， 故本研究選擇蛋白酶E 加入量為10 mg。

3.提取時間的優(yōu)化。 提取時間也會影響硒形態(tài)的提取效率。 對比試驗在0.100 g 樣品中分別加入10 mg 蛋白酶E 和10 mL 超純水， 于37℃超聲提取2 次， 設置不同超聲時間。 考察了水浴超聲時間對大豆中硒形態(tài)提取效率的影響， 結果見圖4C。結果表明， 硒形態(tài)提取效率隨著提取時間的延長先升高后降低， 當超聲時間為60 min 時 （超聲2 次，每次30 min）， 提取效率最高， 故本研究選擇提取時間為60 min。

（三） 方法學評價

1.標準曲線與檢出限。 分別配制1.0、 5.0、 10.0、20.0、 100.0 μg/L 的SeCys、 MeSeCys、 Se （IV）、SeMet、 Se （VI） 和SeEt 混合標準工作溶液， 以各濃度色譜峰面積（y） 對應質(zhì)量濃度（x） 繪制標準曲線， 結果見表1。 結果顯示， 在最佳試驗條件下， 各硒形態(tài)在1.0～100.0 μg/L 范圍內(nèi)線性關系良好， 相關系數(shù) （r） 均＞0.999。 采用逐級稀釋法，當待測物的信噪比（S/N） 為3 和10 時， 該濃度為該待測物的檢出限和定量限。 配制5.0、 20.0 和80.0 μg/L 的6 種硒形態(tài)混合標準溶液， 分別測定其日內(nèi)精密度 （n＝6） 和連續(xù)6 d 的日間精密度，結果見表1。

表1 6 種硒形態(tài)的保留時間、 線性范圍、 線性方程、 檢出限及日內(nèi)和日間精密度

2. 加標回收試驗。 按照試驗方法對實際大豆樣品設置低、 中、 高3 個濃度水平的加標回收試驗， 每個濃度水平平行測定6 次， 計算平均回收率和測定值相對標準偏差 （RSD）。 6 種硒形態(tài)的精密度和回收試驗的結果見表2。 結果顯示， 6 種硒形態(tài)的加標回收率在86.5%～108.0%之間， RSD均≤7.0%， 說明方法的重復性良好， 精密度高。

表2 大豆樣品中3 個水平濃度加標回收結果 （n＝6）

3. 實際樣品測定。 在上述儀器條件下， 用建立的方法對4 個大豆實際樣品 （標號為大豆1、 大豆2、 大豆3、 大豆4） 進行檢測， 結果見表3。 結果顯示， 總硒含量越高， 樣品中硒的存在形態(tài)越多， 有機硒含量越豐富。 4 個大豆實際樣品中均檢出了SeMet， 且含量相對較高， 可判定SeMet 是大豆中的主要硒形態(tài)。 其中， 大豆1 樣品中檢出4 種硒形態(tài)， SeMet 占比94.2%， 色譜分離圖見圖5。

表3 實際樣品硒形態(tài)含量測定結果

圖5 大豆1 樣品中硒形態(tài)色譜分離圖

三、 結論

本研究采用超聲輔助蛋白酶水解提取的前處理方法， 通過對色譜分離條件和前處理提取條件的優(yōu)化， 建立了利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜測定大豆中SeCys、 MeSeCys、 Se （IV）、 SeMet、Se （VI） 和SeEt 等6 種硒形態(tài)的分析方法。 6 種硒形態(tài)在1.0～100.0 μg/L 范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù) （r） ＞0.999， 檢出限為0.05～0.13 μg/L，6 種硒形態(tài)的加標回收率在86.5%～108.0%之間，RSD 均在7.0%以內(nèi)。 通過實際樣品的測定， 發(fā)現(xiàn)SeMet 是大豆中的主要硒形態(tài)。 該分析方法具有快速分離及檢出限低等特點， 6 種硒形態(tài)能在14 min內(nèi)有效分離， 適用于大豆中硒形態(tài)分析。