食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法研究

徐愛(ài)民 郭國(guó)棟 何曉軍

摘 要：本文針對(duì)食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法進(jìn)行探究。采用文獻(xiàn)總結(jié)法，從金黃色葡萄球菌的特點(diǎn)、危害、耐藥性入手，詳細(xì)介紹了傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)、快速檢測(cè)法在食品中金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用，為實(shí)際檢測(cè)工作開(kāi)展提供參考，保證食品質(zhì)量與安全。

關(guān)鍵詞：食品；金黃葡萄球菌；檢測(cè)技術(shù)；質(zhì)量安全

Study on Detection Method of Staphylococcus aureus in Food

XU Aimin， GUO Guodong， HE Xiaojun

（Heze Food and Drug Inspection and Testing Institute， Heze 274000， China）

Abstract： In this paper， the detection method of Staphylococcus aureus in food was explored. By the method of literature review， starting from the characteristics， harm and drug resistance of Staphylococcus aureus， the application of traditional culture method， immunological method， molecular biology and rapid detection method in the detection of Staphylococcus aureus in food was introduced in detail， to provide reference for the actual inspection work to ensure food quality and safety.

Keywords： food; Staphylococcus aureus; detection technology; quality and safety

金黃葡萄球菌是革蘭陽(yáng)性菌，廣泛存在于空氣、水體、人與動(dòng)物的排泄物中，很容易污染肉、蛋、奶等食物。其引起的食物中毒現(xiàn)象，是一個(gè)世界性的衛(wèi)生問(wèn)題[1]。近年來(lái)，隨著人們生活節(jié)奏的加快，快餐成為一種常見(jiàn)的用餐方式，與此同時(shí)人們更加關(guān)注食品安全問(wèn)題。根據(jù)不同的食品種類(lèi)，選擇合適的檢測(cè)技術(shù)方法，既能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，又能提高效率、有效控制成本，是從業(yè)人員的重要研究課題。本文結(jié)合筆者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)有研究成果，對(duì)食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

1 金黃葡萄球菌概述

1.1 金黃葡萄球菌的特點(diǎn)

金黃葡萄球菌多為球狀或橢圓狀，一般聚集排列成葡萄串，可產(chǎn)生黃色的脂溶性色素。它對(duì)熱、鹽、干燥均有較強(qiáng)的抵抗能力，在80 ℃下可存活30 min，在10%的氯化鈉溶液中可長(zhǎng)期存活并繁殖，在干燥的膿液、痰液中可存活2～3個(gè)月。金黃葡萄球菌一般分為A、B、C、D、E這5個(gè)類(lèi)型，以A型腸毒素引起的中毒最為多見(jiàn)[2]。

1.2 金黃葡萄球菌的危害

正常情況下，機(jī)體可在一定程度上抵抗金黃葡萄球菌感染；但當(dāng)皮膚黏膜受損、機(jī)體免疫力降低時(shí)，病原侵入機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生危害。一類(lèi)是侵襲性疾病，以組織感染為特征，常見(jiàn)如皮膚感染、傷口化膿、內(nèi)臟器官感染、敗血癥等。另一類(lèi)是毒素性疾病，以食物中毒、毒素休克綜合征為特征，常見(jiàn)如急性胃腸炎、高熱、腹瀉、皮疹等。對(duì)此，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）中，明確規(guī)定了金黃葡萄球菌在8大類(lèi)食品中的檢測(cè)限量。

1.3 金黃葡萄球菌的耐藥性

隨著細(xì)菌感染引起的疾病越來(lái)越多，臨床上對(duì)于抗生素的使用不合理，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。相關(guān)研究證實(shí)，金黃葡萄球菌對(duì)多種抗生素具有耐藥性，較為常見(jiàn)且嚴(yán)重的是耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素金黃葡萄球菌[3]。

2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法在食品中金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）中規(guī)定傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測(cè)的國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)定性與定量檢測(cè)。該方法雖然成本低廉，但檢驗(yàn)操作復(fù)雜，整個(gè)檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，需要5 d左右才能得到檢驗(yàn)結(jié)果。區(qū)楚君等[4]以冷凍肉及肉制品為對(duì)象，針對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)法受雜菌干擾導(dǎo)致假陰性較高的問(wèn)題，對(duì)分離方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的分離率從2.61%提高至19.98%，有效避免了假陰性現(xiàn)象的發(fā)生。

3 免疫學(xué)方法在食品中金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)是使用有抗體的彩色乳膠顆粒，對(duì)金黃葡萄球菌細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)，若懸液中有特異性抗原，就會(huì)發(fā)生凝集或沉淀。該試驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速，缺點(diǎn)是靈敏度不高，需在檢測(cè)前進(jìn)行增菌處理。以法國(guó)生物梅里埃公司為例，對(duì)樣品進(jìn)行24 h增菌處理，只需20 s就能得到陽(yáng)性或陰性結(jié)果。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法在食品檢測(cè)領(lǐng)域的適用范圍廣、技術(shù)成熟。其原理是利用固相載體上的抗體，捕捉樣本中的抗原，加入酶標(biāo)抗體后，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物；最后加入顯色底物反應(yīng)后，用肉眼觀(guān)察并使用酶標(biāo)儀判定。該方法的靈敏度不高，需在檢測(cè)前進(jìn)行增菌處理。時(shí)玉菲等[5]針對(duì)金黃色葡萄球菌A型腸毒素，使用單克隆抗體作為捕獲抗體，抗SEA兔多抗血清作為檢測(cè)抗體，建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，檢測(cè)下限為1.89 μg·L-1，回收率為94%～114%，變異系數(shù)小于10%。

3.3 免疫層析檢測(cè)

免疫層析檢測(cè)利用毛細(xì)原理，在硝酸纖維素膜上固定抗體，干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品溶液中，樣品沿著毛細(xì)管移動(dòng)，移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中的抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)顏色變化達(dá)到特異性檢測(cè)目標(biāo)。該方法的檢測(cè)速度快，結(jié)果準(zhǔn)確性較高。布日額等[6]建立牛乳中金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析檢測(cè)方法，結(jié)果顯示最低檢出限為1.0×105 CFU·mL-1，分離鑒定符合率在83.3%～90.0%，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

4 分子生物學(xué)在食品中金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 PCR技術(shù)

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具有快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。由于食品成分較為復(fù)雜，加工過(guò)程中可能破壞DNA，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。對(duì)此，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新可彌補(bǔ)這一缺陷，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、微滴式數(shù)字PCR、多重PCR等。滕要輝等[7]以速凍食品為對(duì)象，針對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌建立了多重PCR檢測(cè)方法，結(jié)果特異性為100%，可檢出菌落數(shù)低于100 CFU·g-1的菌群。

4.2 LAMP技術(shù)

LAMP即DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，適用于基因診斷，顯著特點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高。郭建平等[8]采用LAMP技術(shù)，基于顏色判定對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明基因組靈敏度達(dá)到0.01 fg·μL-1，菌落靈敏度達(dá)到1.9 CFU·mL-1，不僅可靠性和特異性良好，而且不需要特殊設(shè)備。

4.3 RPA技術(shù)

RPA即重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它主要依賴(lài)于3種酶：①能與單鏈核酸結(jié)合的重組酶；②鏈置換DNA聚合酶；③單鏈DNA結(jié)合蛋白，最佳反應(yīng)溫度是37 ℃。該檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：①常溫下檢測(cè)，不需要熱循環(huán)，對(duì)儀器設(shè)備要求低；②僅需少量核酸分子，在3～10 min即可完成檢測(cè)任務(wù)，且一個(gè)人就能完成操作過(guò)程；③能在同一個(gè)管中，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)；④靈敏度高，可滿(mǎn)足定量檢測(cè)要求。在市場(chǎng)應(yīng)用方面，英國(guó)TwistDX公司研發(fā)的TwistAmp產(chǎn)品，可在常溫下完成檢測(cè)，用時(shí)在15 min以?xún)?nèi)，尤其適用于食品安全、生物安全、體外診斷、獸醫(yī)以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[9]。

4.4 SAT技術(shù)

SAT即實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它的標(biāo)靶和擴(kuò)增產(chǎn)物均是RNA，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間較短，熒光信號(hào)經(jīng)熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，可實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。李桂金等[10]采用SAT法檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌，并對(duì)檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示純培養(yǎng)物檢出限為103 CFU·mL-1，靈敏度為100%，假陰性率為0%，假陽(yáng)性率為2.9%，各項(xiàng)結(jié)果均達(dá)標(biāo)。

4.5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，對(duì)DNA或RNA片段進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)樣本中某個(gè)特定微生物的核苷酸順序。不同微生物的基因序列不同，因此該檢測(cè)技術(shù)具有先進(jìn)性。然而，食品中金黃葡萄球菌的含量少，一般不直接采用核酸探針檢查，目前只有少數(shù)公司在研究推廣該技術(shù)。例如，美國(guó)GEN-Probe公司研制的AccuProbe試劑，可在72 h內(nèi)對(duì)食品中的金黃葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。

5 快速檢測(cè)法在食品中金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測(cè)的國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)定性與定量檢測(cè)。但是，食品檢測(cè)具有工作量大、范圍廣的特點(diǎn)，傳統(tǒng)培養(yǎng)法在操作方法和檢測(cè)周期上不具有優(yōu)勢(shì)，不能滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需求。對(duì)此，相關(guān)企業(yè)和從業(yè)人員對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行優(yōu)化改良，形成快速檢測(cè)技術(shù)，以顯色培養(yǎng)基法、鑒別培養(yǎng)基法、紙片法為代表，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

5.1 顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶，加入顯色底物后反應(yīng)顯色實(shí)現(xiàn)檢測(cè)效果，在特異性酶的作用下，通過(guò)觀(guān)察菌落的顏色對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，其特異性和靈敏度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。周霞霞等[11]對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、食品樣本分離菌株采用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)，并與國(guó)標(biāo)法、微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示顯色培養(yǎng)基能快速鎖定疑似目標(biāo)菌落，定量檢測(cè)與其他方法在計(jì)數(shù)值上無(wú)顯著性差異。

5.2 鑒別培養(yǎng)基法

鑒別培養(yǎng)基法是在培養(yǎng)基中加入試劑或化學(xué)藥品，不同微生物對(duì)這些成分的分解能力不同，指示劑對(duì)不同菌落顯示不同顏色，達(dá)到鑒別與區(qū)分的效果。法國(guó)生物梅里埃公司研制的Baird Parket+RPF培養(yǎng)基，加入兔血漿，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，得到不透明的菌落即是金黃色葡萄球菌。仇華磊等[12]以導(dǎo)致奶牛發(fā)生乳腺炎的金黃色葡萄球菌為對(duì)象，在Baird-parker培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇mBP培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)液是否渾濁、產(chǎn)生黑色物質(zhì)，判斷奶樣中金黃色葡萄球菌對(duì)所試抗生素的敏感性。該方法簡(jiǎn)單、快速，不需使用專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，具有較高推廣價(jià)值。

5.3 紙片法

美國(guó)3M公司生產(chǎn)的第2代金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)紙片，檢測(cè)過(guò)程包括兩個(gè)階段：第一階段使用改良后的B-P培養(yǎng)基，含有金黃色葡萄球菌的樣本培養(yǎng)24 h后，在紙片上呈現(xiàn)為暗紫色；第二階段若呈現(xiàn)為其他顏色，就使用含有顯色劑和DNA的確認(rèn)反應(yīng)片，1～3 h后金黃色葡萄球菌形成粉紅色環(huán)，其他菌落不會(huì)形成，作為鑒別判斷依據(jù)。孫鑫澤等[13]的研究中，以乳制品、熟肉制品和方便食品為對(duì)象，對(duì)比紙片法和B-P平板法對(duì)金黃色葡萄球菌的檢出率和用時(shí)，結(jié)果顯示兩種方法的檢出率無(wú)明顯差異，但紙片法檢測(cè)用時(shí)明顯縮短。

此外還有其他檢測(cè)技術(shù)，如生物素標(biāo)記法、魯米諾信號(hào)化學(xué)發(fā)光法、BAX Q7全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)等[14]。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，食品衛(wèi)生安全直接關(guān)系到人體健康，金黃葡萄球菌檢測(cè)一直是食品檢測(cè)的一個(gè)重要項(xiàng)目。文章以傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)、快速檢測(cè)法為例，闡述了其在金黃葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀。未來(lái)，快速檢測(cè)技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、成本低廉、方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的市場(chǎng)發(fā)展前景，將會(huì)成為一個(gè)重點(diǎn)發(fā)展方向。

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