膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

梁才英

摘 要：食品安全問題是全球關(guān)注熱點(diǎn)，近年來我國種植技術(shù)發(fā)展迅猛，農(nóng)藥的使用也逐步科學(xué)、規(guī)范，但仍舊無法避免食品中的農(nóng)藥殘留問題，如何有效檢測(cè)成為重難點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要介紹膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用原理及特點(diǎn)，并以克百威為例具體分析了膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示膠體金免疫層析技術(shù)操作便捷、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用效果優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留檢測(cè)；膠體金免疫層析；克百威

Application of Colloidal Gold Immunochromatography in the Detection of Pesticide Residues

LIANG Caiying

（Qinzhou Qinbei District Mongolia Town Agricultural and Rural Service Center， Qinzhou 535000， China）

Abstract： Food safety is a hot topic of global attention. In recent years， Chinas planting technology has developed rapidly， and the use of pesticides is gradually scientific and standardized， but it is still impossible to avoid pesticide residues in food， and how to effectively detect has become a key and difficult point. This paper briefly introduces the application principle and characteristics of colloidal gold immunochromatography technology， and specifically analyzes the application of colloidal gold immunochromatography technology in pesticide residue detection. The results show that colloidal gold immunochromatography technology is convenient to operate， has accurate detection results， and has excellent application effect in pesticide residue detection.

Keywords： pesticide residue detection; colloidal gold immunochromatography; budweiser

農(nóng)藥能夠有針對(duì)性地預(yù)防、控制并消除病蟲草，主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)以及漁業(yè)等產(chǎn)業(yè)中，保障植物、動(dòng)物的生長與繁殖，對(duì)于提高產(chǎn)量有著非常重要的作用。我國關(guān)于農(nóng)藥的使用有著十分完善的管理制度，但仍舊無法完全規(guī)避農(nóng)藥濫用、泛用等問題，不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了較大的破壞，也威脅著人們的生命健康。常見的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要包括大型儀器檢測(cè)和免疫檢測(cè)，雖然前者檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率較高，但操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長且花費(fèi)較高，不適用于流通時(shí)間較短的果蔬。膠體金免疫層析技術(shù)屬于后者，1971年首次出現(xiàn)，主要是利用膠體金作為示蹤標(biāo)志物，以纖維層析材料為固相反應(yīng)界面，利用抗原抗體的特異性結(jié)合原理，在毛細(xì)作用下觀察樣品溶液中膠體金產(chǎn)物的定向流動(dòng)[1-2]，

操作便捷且檢測(cè)快速，除了應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)之外，還廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品檢測(cè)、重金屬等環(huán)境污染物的檢測(cè)中，檢測(cè)效果理想。

1 膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用原理及特點(diǎn)

1.1 原理

膠體金也被稱為氯金酸水溶液，與白磷和檸檬酸三鈉結(jié)合能夠在還原反應(yīng)、聚合反應(yīng)作用下形成一種大小基本相等的顆粒物質(zhì)，此類顆粒物質(zhì)在受到靜電作用時(shí)還會(huì)反應(yīng)形成一種膠體溶液[3]。其電子密度極高、穩(wěn)定性極強(qiáng)，如果顆粒物質(zhì)的聚集密度超過規(guī)定閾值，其表面還會(huì)形成面積較大的紅色斑點(diǎn)，便于肉眼或儀器觀察，檢驗(yàn)人員只需要觀察被檢測(cè)物質(zhì)中的紅色斑點(diǎn)數(shù)量便可以得出結(jié)果，因此，如果將膠體金作為免疫層析檢測(cè)中的指示物，則能夠以膜為載體，完成對(duì)特殊抗原或抗體的固定，繼而實(shí)現(xiàn)毛細(xì)作用下被測(cè)物質(zhì)在層析試條上的持續(xù)運(yùn)動(dòng)[4]。此外，需要注意的是，不同還原劑所產(chǎn)生的顆粒是不同的，在檢測(cè)過程中會(huì)呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，而膠體金能夠滿足不同物質(zhì)的檢測(cè)需要，并能最大限度確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.2 特點(diǎn)

膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單且具有較高的靈敏度，主要呈現(xiàn)出以下特點(diǎn)：①該檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)范圍較廣，除了能夠檢測(cè)出食品等被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留，還能檢測(cè)出微生物、真菌霉素等，甚至可以同步檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)是否含有違禁藥品；②該檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)方法十分便捷，只需要簡(jiǎn)單處理樣品后肉眼觀察即可，不需要借助設(shè)備或儀器便能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此不要求檢測(cè)人員具有高超的知識(shí)與專業(yè)技能；③相比于傳統(tǒng)的酶標(biāo)記、放射性同位素以及熒光素等檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)所使用的試劑安全性更高，既能夠保證檢測(cè)環(huán)境無污染，還能避免對(duì)檢測(cè)人員的身體造成傷害；④當(dāng)前市面上流通的膠體金免疫層析檢測(cè)卡靈敏度為1 ng·mL-1，相比于其他檢測(cè)方法具有更高的靈敏度，這是因?yàn)樵摍z測(cè)技術(shù)只需要標(biāo)記單克隆抗體，同時(shí)對(duì)其有特異性、親和性的只有抗原決定簇[5]；⑤該檢測(cè)技術(shù)所使用的試條具有較為穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，主要是膠體金吸附被測(cè)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附并標(biāo)記，且不會(huì)影響到蛋白質(zhì)活性，同時(shí)兼具質(zhì)量小的特點(diǎn)，便于檢測(cè)人員隨身攜帶并隨時(shí)展開現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用——以克百威為例

2.1 克百威介紹

克百威是一種高效殺蟲劑，屬于氨基甲酸酯類，應(yīng)用于蔬菜、糧食、水果等農(nóng)作物中能夠有效防治害蟲，應(yīng)用時(shí)會(huì)將其直接噴灑在農(nóng)作物根部，待根系吸收后隨著水分傳送至葉子、莖部，實(shí)現(xiàn)內(nèi)吸殺蟲的效果。但是，克百威具有較高的毒性，一旦暴露在空氣中，很長時(shí)間都不會(huì)消散，不僅無法在酸性土壤中降解，會(huì)污染土壤和地下水，還會(huì)威脅到周邊鳥類及水生動(dòng)植物的安全。如果在農(nóng)作物上大量使用克百威，便會(huì)形成農(nóng)藥殘留。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，克百威會(huì)影響到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的血清活性，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致肝臟的充血性壞死。大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明克百威有著較為顯著的肝毒性作用與致突變性，如果食品中殘留有克百威，則會(huì)嚴(yán)重危及人們的生命健康[6]。

2.2 膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)克百威的具體方法

2.2.1 膠體金單克隆抗體偶聯(lián)物的制作

在膠體金懸浮液中加入0.2 mol·L-1的碳酸鉀溶液，一邊攪拌一邊加入抗體溶液直至溶液的酸堿度達(dá)到8.2、濃度達(dá)到2 μg·mL-1，將溶液溫育30 min后加入1%濃度的牛血清白蛋白溶液，持續(xù)攪拌20 min以確保膠體金的穩(wěn)定性。將得到的溶液混合物在4 ℃環(huán)境中作離心處理，時(shí)間大約為15 min，結(jié)束后再用1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行溶液沉淀，通常需要洗滌3次，沉淀后將沉淀物放入含有1%牛血清白蛋白和0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，將其保存于4 ℃的環(huán)境中備用。整個(gè)過程需要特別注意溶液酸堿度的檢測(cè)，且將備好的膠體金抗體偶聯(lián)物用在試紙條的準(zhǔn)備中則能夠檢測(cè)出其性能。

2.2.2 膠體金試紙條的組裝

目前市面上常見的試紙條包括硝酸纖維素膜、共軛墊、吸收墊和樣品墊。當(dāng)克百威樣品溶液被加入到樣品墊時(shí)，在層析作用力下會(huì)定向流動(dòng)至吸收墊，此時(shí)樣品溶液中的抗原便會(huì)與共軛墊上的膠體金標(biāo)記結(jié)合，而后繼續(xù)移動(dòng)，與對(duì)照線上的抗原、抗體結(jié)合，此時(shí)由于膠體金標(biāo)記無法與測(cè)試線包被抗原結(jié)合，測(cè)試線上的顏色越淺，樣本溶液中的抗原濃度就越高。利用點(diǎn)樣儀（型號(hào)為BioDot Quanti3000）在硝酸纖維素膜上加入山羊抗小鼠IgG作為對(duì)照線，加入3-琥珀酰-克百威-OVA作為測(cè)試線，再用點(diǎn)樣儀將備好的膠體金單克隆抗體偶聯(lián)物固定到共軛墊上，組裝好膠體金條與外殼則完成試條的組裝，將其保存于4 ℃的環(huán)境中。膠體金試紙條的最小濃度以測(cè)試線完全不可見為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)試紙條中加入克百威樣品，則測(cè)試線的顏色通常比對(duì)照線的顏色淺，如果在試紙條中加入空白溶液，則測(cè)試線與對(duì)照線的顏色相同，如果加入溶液后沒有出現(xiàn)對(duì)照線，則表示樣品無效[7]。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

膠體金試紙的檢測(cè)限就是使測(cè)試線完全不可見的最小濃度，因此將一系列梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度加入試紙條中，即0 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1和20.00 ng·mL-1，當(dāng)膠體金測(cè)試線相比對(duì)照線明顯較弱時(shí)，得到克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1。

2.3 檢測(cè)結(jié)論分析

本次研究中利用膠體金分別檢測(cè)了不同濃度的克百威試紙條，結(jié)果顯示膠體金對(duì)克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1，而根據(jù)調(diào)查，如果隱形添加的克百威濃度超過2%，稀釋1 000倍后的克百威含量仍不低于20 mg·L-1，所以應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)能夠檢測(cè)出市面上絕大多數(shù)物品中的克百威濃度超標(biāo)問題。另外，本次測(cè)試沒有特別使用緩沖液或純凈水，只需要用自來水將被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行稀釋便可直接檢測(cè)，不需要采用特定的純凈水或緩沖液，便于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)，更加適用于稀釋條件不高的環(huán)境，可以簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)出被測(cè)物品中是否有克百威農(nóng)藥殘留。

3 膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)

膠體金免疫層析技術(shù)最早應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，近幾年隨著我國對(duì)食品安全問題的重視，才逐漸延伸至安全質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，如農(nóng)藥殘留檢測(cè)等。利用膠體金作為單一常規(guī)標(biāo)記材料，可直觀顯示被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留。在未來，科技的進(jìn)步使得大量新型材料相繼問世，納米磁珠、鑭系稀土、熒光微球等新型材料均可作為標(biāo)記材料代替膠體金[8-9]。技術(shù)的革新要求相關(guān)研究人員不斷提升專業(yè)知識(shí)與技能儲(chǔ)備，充分利用多種標(biāo)記材料以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的進(jìn)一步優(yōu)化?？偟膩碚f，膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)主要是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記材料的不斷升級(jí)。只有實(shí)現(xiàn)標(biāo)記材料的升級(jí)優(yōu)化，才能不斷提升檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)效率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性。

當(dāng)前膠體金層析免疫技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用效果良好。膠體金免疫層析技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留，操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確率高，試紙條也便于攜帶，能夠在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)完成檢測(cè)工作，其檢測(cè)原理主要是識(shí)別抗體、抗原或半抗原之間的特異性反應(yīng)，是一種以此為基礎(chǔ)所建立的生物化學(xué)分析方法，但是在檢測(cè)之外，檢測(cè)人員還需要對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的前期處理。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，部分被測(cè)物質(zhì)的前期處理工作十分煩瑣，且每一次檢測(cè)都需要使用一個(gè)試紙條，導(dǎo)致檢測(cè)成本增加。因此，膠體金免疫層析技術(shù)的未來發(fā)展方向要著重于高通量試紙條或檢測(cè)卡的研究，以不斷減少成本。

另外，在以往傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)中通常只能檢測(cè)出一種農(nóng)藥殘留，且屬于定性檢測(cè)，或者對(duì)被測(cè)物質(zhì)中的某種農(nóng)藥殘留進(jìn)行半定量檢測(cè)。如果被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留量超過膠體金試紙條所能檢測(cè)出的最大限量，則無法準(zhǔn)確定量地檢測(cè)出實(shí)際殘留。對(duì)此，相關(guān)研究人員不斷優(yōu)化檢測(cè)試紙條與檢測(cè)方法，以期能夠不斷擴(kuò)大定量精度、檢測(cè)范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將單一顏色的檢測(cè)線進(jìn)行多條組合，然后將其置于同一層析膜上，則能夠大大提升膠體金試紙條的檢測(cè)效果，對(duì)單一農(nóng)藥殘留的定性或?qū)Χ喾N類農(nóng)藥殘留的定量分析，在節(jié)省檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)還能為檢測(cè)人員提供更多的關(guān)聯(lián)信息。需要注意的是，樣品墊與檢測(cè)線之間的距離越大，被測(cè)溶液層析后到達(dá)檢測(cè)線的時(shí)間就越長，加上無法避免多條檢測(cè)線之間相互干擾，因此檢測(cè)結(jié)果無法達(dá)到預(yù)期[10]。若要實(shí)現(xiàn)膠體金層析技術(shù)在多種農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)效果，僅在單層析膜上添加多條檢測(cè)線是不夠的。應(yīng)用多條檢測(cè)線的膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，除了需要考慮到靈敏度、特異性、產(chǎn)品穩(wěn)定性等常規(guī)量之外，還應(yīng)當(dāng)充分考慮到多條檢測(cè)線之間的距離，被測(cè)物質(zhì)層析速度以及檢測(cè)時(shí)的浸提液使用量等，不斷優(yōu)化試紙條材質(zhì)，以逐步提高檢測(cè)線的顯示清晰度和均勻度，最大限度保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)語

綜上所述，在進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，相比于需要利用大型儀器的氣相色譜、液相色譜等檢測(cè)技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)操作更加簡(jiǎn)單，所獲得的檢測(cè)結(jié)果也準(zhǔn)確可靠，更加適用于快速篩查果蔬等物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留。膠體金免疫層析技術(shù)僅僅是免疫檢測(cè)方法中的一種。已經(jīng)有研究表明，多種方式聯(lián)合檢測(cè)能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，因此在未來，免疫層析的多組分檢測(cè)方法將成為一種主流應(yīng)用趨勢(shì)，農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的選擇依據(jù)則會(huì)趨向于減少檢測(cè)成本，并同步滿足被測(cè)物質(zhì)中多種農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)需求。

參考文獻(xiàn)

[1]張瑜，惠光朋，王志恒，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)禽蛋中甲硝唑殘留分析研究[J].山東畜牧獸醫(yī)，2022，43（11）：18-21.

[2]宋姣，何婷婷，齊冬琴.膠體金免疫層析技術(shù)在食品快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品，2022，28（21）：75-77.

[3]梁科，黃紫茵，葉秋雄，等.膠體金法快速檢測(cè)茶葉中甲氰菊酯農(nóng)藥殘留[J].食品安全導(dǎo)刊，2021（30）：54-55.

[4]葉茂，沈曉玲，陳青舟，等.膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)果蔬中四種農(nóng)藥殘留[J/OL].食品工業(yè)科技：1-12[2023-12-04].https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=3uoqIhG8C45S0n9fL2suRadTyEVl2pW9UrhTDCdPD65GWj5UxcG6fiU3Tw0A4l5GsgSpXx_4tVn-60Pp2VNuspGvTehn2Ksu&uniplatform=NZKPT.

[5]吉美奇，王維力，石三俊，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)果蔬中的三唑酮及其代謝物殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2022，13（14）：4519-4526.

[6]栗慧，于苗，劉培，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中土霉素殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2022，13（5）：1524-1530.

[7]徐穎.膠體金免疫層析技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品，2022，28（2）：69-71.

[8]周佳，何丹，王炳志，等.膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)果蔬中克百威、水胺硫磷、百菌清及蟲酰肼的應(yīng)用研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（19）：7606-7610.

[9]楊琳芬，萬宇平，崔廷婷，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)水果中三氯殺螨醇?xì)埩鬧J].農(nóng)藥，2021，60（2）：131-134.

[10]羅俊霞，張剛，申戰(zhàn)賓，等.膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2022（1）：41-49.