異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌的分子分型和同源性分析

胡遠芳 付明霞 王鳳霞 李娜 梁進 王月玲 紀冰

摘要：目的 了解濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（hVISA）的分子流行病學(xué)現(xiàn)狀，為有效預(yù)防hVISA的傳播提供依據(jù)。方法 采用萬古霉素瓊脂平皿篩選法對263株金黃色葡萄球菌進行初篩，菌群分析-曲線下面積（PAP-AUC）法對初篩陽性的hVISA可疑株進行確認。采用多位點序列分型（MLST）、葡萄球菌A蛋白基因（spa）分型和脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型方法對hVISA菌株進行分子分型和同源性分析。結(jié)果 本院初篩出113株hVISA可疑株，最終確認為hVISA的菌株共22株。MLST分型以ST72型（5株）為主，其次為ST59和ST25型（各4株）；spa分型主要為t002、t437以及t2431（各3株）。PFGE聚類分析共得到12種PFGE型別，命名為H1-H12型，相似值處于62.6%～100%之間，其中最主要的是H3型（共6株），其次為H1型（共4株）。結(jié)論 ? ?hVISA在本院為散發(fā)，22株hVISA菌株共檢出10種ST型，14種spa型和12種PFGE型。本院hVISA菌株的主要流行克隆為ST72-t2431-H3型，且均來源于兒科，兒科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA的流行。

關(guān)鍵詞 異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌；多位點序列分型；葡萄球菌A蛋白基因分型；脈沖場凝膠電泳分型

中圖分類號：R378.11 ?文獻標(biāo)志碼：A

Molecular typing and homology analysis of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus

Hu Yuan-fang1， Fu Ming-xia2， Wang Feng-xia1， Li Na1， Liang Jin1， Wang Yue-ling3， and Ji Bing1

（1 Department of Clinical Laboratory， Bingzhou Medical University Hospital， Binzhou 256600; 2 Department of Pathology， Binzhou peoples hospital， Binzhou 256600；3 Department of Clinical Laboratory， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University， Ji'nan 250021）

Abstract Objective To investigate the molecular epidemiological status of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus （hVISA） in Bingzhou Medical University Hospital， and to provide evidence for effective prevention of hVISA transmission. Methods ? ?263 strains of Staphylococcus aureus （S. aureu） were screened for hVISA by vancomycin brain heart infusion agar plate， and hVISA strains were validated by the modified population analyzed profile-area under the curve （PAP/AUC） method. The molecular typing and homology of hVISA strains were analyzed by multilocus sequence typing （MLST）， staphylococcal protein A （spa） typing and pulsed field gel electrophoresis （PFGE） typing. Results There were 113 screening positive strains in 263 strains of S. aureus， and 22 strains were confirmed to be hVISA positive by PAP/AUC. The MLST typing results showed that the strain types were mainly the ST72 type （5 strains）， followed by the ST59 type （4 strains）， and the ST25 type （4 strains）. The main types of spa were t002， t437， and t2431 （3 strains each）. PFGE cluster analysis revealed a total of 12 PFGE types， named H1-H12， with similarity ranging from 62.6% to 100%. Among them， H3 type was the most important （6 strains）， followed by H1 type （4 strains）. Conclusion hVISA was sporadic in our hospital， and a total of 10 ST types， 14 spa types， and 12 PFGE types were detected in 22 hVISA strains. The main epidemic clone of hVISA strain in our hospital was ST72-T2431-H3， and they were all from pediatrics. There may be an epidemic of ST72-T2431-H3 hVISA in pediatrics.

Key words Heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus; MLST typing; spa typing;

PFGE typing

金黃色葡萄球菌是一種重要的革蘭陽性病原菌，可引起肺炎、腦膜炎和菌血癥等多種感染性疾病。據(jù)報道，金黃色葡萄球菌的基因型會影響感染的并發(fā)癥、嚴重程度和死亡率[1]。目前，關(guān)于金黃色葡萄球菌的分子分型方法主要包括脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis， PFGE）、多位點序列分型（mutilocus sequence typing， MLST）、葡萄球菌盒式染色體mec（Staphylococcal Cassette Chromosome mec， SCCmec）分型以及葡萄球菌A蛋白基因（Staphylococcal Protein A， spa）分型等[2]。PFGE分型主要是對細菌的整體DNA進行分析，通過合適的限制性內(nèi)切酶將DNA切成大小不一的特定片段，利用PFGE技術(shù)將這些片段進行分離，根據(jù)條帶的大小和數(shù)量對菌株進行分型[2]。MLST分型是一種主要用于菌株間遺傳進化分析的病原菌分型方法[3]，該方法以核苷酸序列為基礎(chǔ)，直接對7個管家基因的每個基因座位進行測序，測序產(chǎn)物上傳到國際網(wǎng)站上與標(biāo)準(zhǔn)克隆株的序列進行比較，從而鑒定其型別。spa分型是一種根據(jù)X區(qū)重復(fù)序列的數(shù)量和序列變異來進行分型的方法，將X區(qū)重復(fù)序列的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）產(chǎn)物測序結(jié)果上傳相關(guān)網(wǎng)站，從而確定其型別。

近年來，關(guān)于異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus， hVISA）的報道越來越多[4]，但其遺傳機制尚不清楚，且不同國家和地區(qū)的hVISA菌株的主要流行克隆可能會有較大差異[5]。因此，本研究采用PFGE、MLST和spa分型方法對濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院hVISA菌株進行分子分型研究，旨在了解本地區(qū)hVISA菌株的分子流行病學(xué)現(xiàn)狀，為臨床預(yù)防和控制hVISA的傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集2019年6月—2019年12月以及2020年7月—2020年8月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，排除同一患者的重復(fù)標(biāo)本以及臨床資料等缺失的標(biāo)本后共計263株。所有納入研究的標(biāo)本均為合格標(biāo)本且與臨床資料相符。ATCC29213為本科室所留存。MU3及MU50為安徽省立醫(yī)院檢驗科戴媛媛老師所贈。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和XbaⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K購自德國Merck公司；TBE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；Gelred和溶葡萄球菌酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、Cel-Red核酸凝膠染料、DNA Maker 1000和PCR試劑均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

采用回顧性分析方法，從實驗室信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS）提取本研究所涉及的263例患者的相關(guān)臨床資料，并對其臨床特征進行調(diào)查分析。本研究所涉及內(nèi)容已通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研倫理委員會審批。

1.2.1 痰培養(yǎng)標(biāo)本的采集與合格標(biāo)本

標(biāo)本采集：患者晨起先用漱口液漱口后，再用清水漱口數(shù)次，用力咳，待有痰液咳出時立即用無菌痰盒收集，蓋上痰蓋后及時送檢。

合格標(biāo)本：肉眼觀察呈黃色、灰色、鐵銹色，渾濁、稠厚、混有團塊或血性的標(biāo)本為合格標(biāo)本；固定染色后普通顯微鏡觀察，或以相差顯微鏡直接觀察濕片，痰標(biāo)本中含白細胞、膿細胞和支氣管柱狀上皮細胞較多，來自頰黏膜的扁平鱗狀上皮細胞較少。以白細胞＞25個/低倍鏡視野，鱗狀上皮細胞＜10個/低倍鏡視野，為合格標(biāo)本。

1.2.2 hVISA菌株的篩選和確認

（1）篩選 hVISA菌株的篩選參考文獻[6]并加以改進：分別吸取10 μL濃度為1.5×108 CFU/mL的菌懸液點種在萬古霉素濃度為2、3和4 mg/L的腦心浸液瓊脂平皿（BHIV2、BHIV3和BHIV4）上。室溫晾干后放于37℃溫箱培養(yǎng)，24和48 h各觀察一次，以48 h后平皿上有≥1個菌落為陽性。ATCC29213為陰性對照，Mu3為hVISA陽性對照，Mu50為萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（vancomycin-intermediate S. aureus，VISA）陽性對照。

（2）確認 采用菌群分析-曲線下面積（PAP-AUC）法對篩選陽性的菌株進行確認，操作方法和結(jié)果判定等參考文獻[7]。含濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、6和8 mg/L萬古霉素的腦心浸液瓊脂平皿制備方法參照文獻[8]。

1.2.3 DNA的提取與分子分型

（1）DNA的提取 參考試劑說明書提取hVISA菌株的基因組DNA。

（2）PFGE分型 參考金黃色葡萄球菌PFGE操作規(guī)程對hVISA菌株進行PFGE分型。使用BioNumerics 5.6軟件分析電泳圖譜，根據(jù)DNA條帶的位置和數(shù)量，以Dice系數(shù)（SD）計算相似值，非加權(quán)組平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進行聚類分析，條帶位置差異容忍度為1.5%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。SD=[2（nxy）]/（nx+ny），nxy是X菌株和Y菌株共有的條帶數(shù)，nx是X菌株的條帶數(shù)量，ny是Y菌株的條帶數(shù)量。

（3）MLST分型 采用PCR法擴增hVISA菌株的7個管家基因（arcC、aroE、glp、gmk、pta、tpi和yqil），引物設(shè)計參考文獻[9]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增條件參照試劑說明書，擴增結(jié)束后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，陽性標(biāo)本經(jīng)純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在www.pubmlst.org上進行比較，確定其ST型別。

（4）spa分型 根據(jù)文獻[10]設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增金黃色葡萄球菌蛋白A重復(fù)區(qū)域，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果上傳Ridom SpaServer網(wǎng)站，確定其spa型別。

1.2.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)使用IBM SPSS24.0軟件（美國IBM公司）進行統(tǒng)計和分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗和Fishers精確檢驗，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PFGE分型電泳圖譜使用BioNumerics 5.6軟件（比利時Applid Maths公司）進行分析，應(yīng)用UPGMA進行聚類分析，Dice相關(guān)度分析方法分析相似度系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 hVISA菌株的篩選及確認結(jié)果

263株金黃色葡萄球菌經(jīng)篩選共得到113株hVISA可疑株，其中BHIV2篩選出108株，BHIV3篩選出24株，BHIV4篩選出5株。113株hVISA可疑株經(jīng)PAP-AUC法確認后共得到22株hVISA，分離率為8.4%。

2.2 臨床特征

22株hVISA菌株對應(yīng)患者的臨床特征見表1。

2.3 hVISA的分子分型結(jié)果

2.3.1 PFGE分型結(jié)果

聚類分析結(jié)果顯示22株hVISA菌株的PFGE帶型相似值處于62.6%～100%之間（圖1）。相似值85%以上的為同一種PFGE型別，22株hVISA共有12種PFGE型別，命名為H1～H12，其中H1型共4株，H3型共6株，H4和H7各2株，其余PFGE型各1株。

2.3.2 MLST和spa分型結(jié)果

hVISA的MLST分型共10種，主要為ST72型。spa分型共發(fā)現(xiàn)14種，主要為t002、t437以及t2431。hVISA的優(yōu)勢克隆為ST72-t2431和ST59-t437。詳細分型結(jié)果（表2）。MLST和spa分型電泳圖（圖2～3）。

3 討論

金黃色葡萄球菌是社區(qū)和醫(yī)院感染的主要原因，仍然是世界各地的一個主要健康問題[11]。萬古霉素作為治療MRSA感染的首選藥物[5]，一直在臨床廣泛使用，但近年來由于過度使用萬古霉素，已經(jīng)出現(xiàn)了萬古霉素不敏感的金黃色葡萄球菌或低水平的萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌，如VISA和hVISA[12]。研究表明，與萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌（vancomycin-susceptible S. aureus，VSSA）感染相比，hVISA引起的感染更容易導(dǎo)致治療失敗，并且由于住院時間延長，醫(yī)療費用也隨之增加[13]。

本研究對濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離的263株金黃色葡萄球菌進行篩選，最終得到22株hVISA菌株，分離率為8.4%。本研究中hVISA的分離率低于劉彩林等[14]報道的鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的hVISA分離率（17.9%），稍高于Shen等[15]報道的中國7個地理區(qū)域（華東，華南，華北，中南，東北，西北和西南）的hVISA分離率（7.6%）以及程華莉等[16]報道的江南大學(xué)附屬醫(yī)院的hVISA分離率（6.4%）。有研究顯示，hVISA分離率的不同可能與地域差異、標(biāo)本量大小以及標(biāo)本組成等相關(guān)，但主要原因是篩選方法不同以及實驗室差異較大[17]。本次研究的對象是金黃色葡萄球菌，而其他研究大多為MRSA，這可能也是導(dǎo)致分離率不同的一個因素，本研究結(jié)果也顯示MRSA組hVISA的分離率高于MSSA組。此外，本研究結(jié)果顯示不同類型的標(biāo)本其hVISA的分離率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此標(biāo)本的類型可能也是影響hVISA分離率的一個因素。

本研究hVISA菌株中MLST和spa分型的主要流行克隆為ST72-t2431和ST59-t437，各3株。胡健等[7]的研究中hVISA菌株的MLST和spa分型以ST5-t002為主，其次為ST239-t030；占志平等[18]和劉彩林等[19]的研究結(jié)果顯示hVISA中MLST和spa分型的主要流行克隆ST239-t030。本次研究中未發(fā)現(xiàn)ST239-t030克隆株，與國內(nèi)hVISA菌株的流行克隆相差較大。盡管本院臨床分離的hVISA菌株并不多，但其MLST和spa分型種類卻較多，其中MLST分型共10種，主要為ST72型（共5株），其次為ST59和ST25型（各4株）；spa分型共14種，主要為t002、t437以及t2431（各3株）。可見本院hVISA的MLST和spa型別比較分散，并沒有特別明顯的優(yōu)勢克隆。

本研究對22株hVISA進行PFGE分型和聚類分析，共發(fā)現(xiàn)12種PFGE型別，其中主要型別為H3型，其次為H1型。對3種分型聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，同一MLST和spa型別的菌株其PFGE型別不完全一致，同一PFGE型別的菌株其MLST和spa型別也不完全相同。結(jié)合臨床資料發(fā)現(xiàn)，來源于兒科的6株hVISA菌株中5株均為ST72-H3型，且其中3株的spa分型均為t2431，但分離時間不同，提示在此期間兒科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA的流行。同源性分析上看，本院22株hVISA的MLST、spa和PFGE型別都較為分散，且散發(fā)的菌株沒有明顯的優(yōu)勢型別，提示本院hVISA的來源較為廣泛。

綜上所述，本院22株hVISA菌株的來源較為廣泛，共檢出10種ST型，14種spa型和12種PFGE型別。本院hVISA的主要流行克隆為ST72-t2431-H3型（共3株），其中MLST和spa分型的主要流行克隆為ST72-t2431和ST59-t437（各3株），PFGE分型的主要型別為H3型（共6株）。兒科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA菌株的流行，兒科應(yīng)該對此予以重視。盡管本次對hVISA的3種分型結(jié)果顯示hVISA在本院為散發(fā)，但還是應(yīng)該予以重視，防止出現(xiàn)hVISA的暴發(fā)。

參 考 文 獻

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收稿日期：2021-12-02

基金項目：山東省自然科學(xué)基金資助項目（No. ZR2020MH306和No. ZR2020MH309）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃基金資助項目（No. 2017WS372）

作者簡介：胡遠芳，女，生于1994年，碩士，初級檢驗師，主要研究方向為臨床微生物，E-mail： hyf27630929@163.com

通訊作者，E-mail： bingji1218@163.com