ARMS-PCR技術(shù)在玫瑰果鑒別中的應(yīng)用

邵婕，楊正修，鄒強(qiáng)，陸崢飛，李凡*

1. 康寶萊蕾碩（湖南）天然產(chǎn)物有限公司（長(zhǎng)沙 410100）；2. 康寶萊全球測(cè)試中心HP1實(shí)驗(yàn)室（托倫斯 90502）

玫瑰果（Rosa canina）在世界上有著悠久的藥食兩用歷史。玫瑰果中多酚、黃酮、維生素C等活性物質(zhì)含量豐富，具有抗氧化、抗癌、抗輻射和抑菌等多種藥理作用[1]*。但玫瑰果原料品種繁多，薔薇屬果實(shí)的化學(xué)成分、抗氧化能力和個(gè)體酚類物質(zhì)含量存在顯著差異[2]*。刺玫果（Rosa duvarica）和玫瑰果屬于同一植物屬，兩者不僅在外觀上非常相似，活性物質(zhì)也非常相似，主要包括黃酮、多糖、三萜等[3]*。由于化學(xué)成分的相似性，常見(jiàn)的化學(xué)鑒定方法難以對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分，使得玫瑰果摻假特別是混合摻假的檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（amplification refractory mutation system-PCR，ARMSPCR）技術(shù)[4]*常用于遺傳疾病[5]*、基因分型[6]*和微生物學(xué)[7]*等許多快速檢測(cè)研究領(lǐng)域，在植物鑒定和分析化學(xué)中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)玫瑰果和刺玫果基因組序列的比較分析，建立一種基于特征SNP位點(diǎn)的ARMS-PCR方法，可用于鑒定玫瑰果和刺玫果。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品Isoquercetin（ChromaDex ASB-00009505-025）。

植物對(duì)照藥材（Botanical Reference Material，BRM）：玫瑰果果實(shí)BRM（Lot 00030792-473，ASB-00030792-005，ChromaDex. Inc）；刺玫果果實(shí)BRM（Lot 121255-201203，121255，購(gòu)自National Institute of Food and Drug Control，NIFDC）。

植物材料：從中國(guó)原料市場(chǎng)采購(gòu)11份玫瑰果用于驗(yàn)證。

Automatic TLC Sampler 4（Chromacim，Moirans，法國(guó)）；硅膠板（60 F254，20×10 cm，Merck，德國(guó)）；CAMAG TLC可視化儀（Chromacim，Moirans，法國(guó)）；DNeasy mericon Food Kit；Qubit 3.0熒光計(jì)（Thermofisher，廣州，中國(guó)）；C1000 Touch（BIORAD，上海，中國(guó)）；Integrated DNA Technologies（Thermofisher，廣州，中國(guó)）；AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix（Thermo Fisher，立陶宛）。

1.2 高效薄層色譜（high-performance thin layer chromatography，HPTLC）

樣品處理：稱取500 mg玫瑰果或刺玫果果實(shí)BRM到15 mL試管中，加入10 mL甲醇，渦旋30 s。超聲處理15 min。將一部分樣品通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾到HPLC進(jìn)樣瓶中。

使用Automatic TLC Sampler 4將樣品噴涂到預(yù)制硅膠板上，Isoquercetin作為化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品噴涂到預(yù)制硅膠板上。用流動(dòng)相（乙酸乙酯/乙酸/甲酸/超純水100/11/11/26）展開(kāi)，使用10%硫酸進(jìn)行顯色。用CAMAG TLC可視化儀和Vision cats軟件拍攝照片。

1.3 DNA提取

DNA提取過(guò)程均根據(jù)制造商的說(shuō)明使用DNeasy mericon Food Kit進(jìn)行。過(guò)程：將50～100 mg玫瑰果或刺玫果果實(shí)BRM，1 mL Food Lysis Buffer和2.5 μL Proteinase K加入離心管中，在60 ℃下孵育30 min，并以2 500×g離心5 min；取700 μL上清液于新的離心管中，加入500 μL氯仿，渦旋15 s，并將混合物以14 000×g離心15 min；將350 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入350 μL PB Buffer，將混合液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，以17 000×g離心1 min；棄去收集管中溶液；向吸附柱中加入500 μL AW2 Buffer，并以17 000×g離心1 min；將收集管中的溶液再次倒出，并將吸附柱以17 000×g離心2 min；將吸附柱放入新的離心管中，加入100 μL TE緩沖液，并將其以17 900×g離心2 min；使用Qubit 3.0熒光計(jì)進(jìn)行定量。

1.4 DNA Barcode序列采集及植物鑒定

使用2對(duì)引物對(duì)玫瑰果和刺玫果gDNA（genomic DNA）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。RbcL-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAACAGAAAC-3’；RbcL-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGTAAAA TCAAGKCCACCRCG-3’；ITS2-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATCCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS2-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。獲得RbcL與ITS2基因片段，通過(guò)sanger測(cè)序獲取序列信息。引物由Integrated DNA Technologies（Thermofisher，廣州，中國(guó)）合成。

雙盲試驗(yàn)：將11份玫瑰果市場(chǎng)樣品與14份刺玫果果實(shí)BRM由試驗(yàn)人員1隨機(jī)編排順序并編號(hào)，通過(guò)DNA barcode技術(shù)對(duì)25個(gè)樣品進(jìn)行鑒定。提取25個(gè)樣品gDNA后，通過(guò)RbcL和ITS2這2對(duì)引物對(duì)gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5分鐘，95 ℃變性30 s（58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果后進(jìn)行Sanger測(cè)序，確認(rèn)樣品種屬信息。試驗(yàn)人員2通過(guò)ARMS-PCR對(duì)25個(gè)樣品進(jìn)行鑒別。

1.6 ARMS-PCR

使用AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix對(duì)玫瑰果與刺玫果的gDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含10 μL AmpliTaq GoldTM*360 Master Mix、2 μL引物混合物（每種引物5 μmol/L）、5 μL gDNA和3 μL Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s（58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×35，72 ℃終末延伸3 min。原始DNA洗脫用于PCR反應(yīng)，無(wú)需調(diào)整濃度。每次運(yùn)行都包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，PCR產(chǎn)品在帶有DNA染料的2%瓊脂糖凝膠中可視化。各基因及其引物的擴(kuò)增引物序列詳見(jiàn)表1。引物由Integrated DNA Technologies合成。

表1 ARMS-PCR引物信息表

1.7 生物信息學(xué)分析

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載所有序列，從NCBI下載的所有序列在MEGA X中使用ClustalW默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行比對(duì)，引物設(shè)計(jì)使用Primer 3.0 plus（https://www.primer3plus.com/）。DNA條形碼序列使用CodonCode Aligner和APE軟件進(jìn)行分析。Sanger測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

雙盲試驗(yàn)所獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)POI（probability of identification）進(jìn)行分析[8]*。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPTLC鑒別玫瑰果和刺玫果

通過(guò)HPTLC方法檢測(cè)玫瑰果和刺玫果，玫瑰果果實(shí)含有Isoquercetin[9]*，以Isoquercetin作為化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品，其位置和可見(jiàn)度如圖1所示。Rf值為0.59。玫瑰果和刺玫果HPTLC指紋圖譜非常相似，兩者之間的主要區(qū)別是檢測(cè)到的條帶的相對(duì)密度。因此，HPTLC難以區(qū)分玫瑰果和刺玫果。

圖1 玫瑰果和刺玫果HPTLC指紋圖譜

2.2 玫瑰果與刺玫果DNA barcode序列采集及引物設(shè)計(jì)

由于植物中ITS和rbcL區(qū)域的選擇壓力小、變異大，因此選擇該區(qū)域進(jìn)行ARMS-PCR分析可更有效地區(qū)分遺傳關(guān)系密切的物種。通過(guò)DNA barcode方法獲取玫瑰果和刺玫果的ITS2和RbcL基因片段，Sanger測(cè)序得到序列信息（表2）。

表2 玫瑰果及刺玫果ITS2和RbcL序列信息

為驗(yàn)證ARMS-PCR區(qū)分玫瑰果和刺玫果的可行性，根據(jù)3個(gè)不同的SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)P1、P2和P3這3種方案。P1方案的設(shè)計(jì)基于RbcL區(qū)域序列，而P2和P3方案的設(shè)計(jì)基于ITS2區(qū)域序列（圖2）。

圖2 候選ARMS-PCR引物在RbcL（P1）和ITS2區(qū)域（P2和P3）中的位置

以P2方案為例，分析ARMS-PCR的工作原理（圖3）。基于SNP位置設(shè)計(jì)4條引物（表1）Outer F，Outer R，Inner F和Inner R，為玫瑰果和刺玫果提供不同長(zhǎng)度的PCR片段。Outer F和Outer R配對(duì)從基因組DNA中擴(kuò)增出1個(gè)182 bp的片段作為內(nèi)參，Inner F和Inner R分別作為玫瑰果和刺玫果的特異性引物。玫瑰果DNA存在時(shí)，Inner F與玫瑰果的DNA模板之間形成完美匹配，Inner F與Outer R配對(duì)擴(kuò)增出1段135 bp的片段。只有當(dāng)Inner R與刺玫果的DNA模板之間形成完美匹配時(shí)，Inner R才能與Outer F配對(duì)擴(kuò)增出1段86 bp片段。DNA模板中只存在玫瑰果DNA時(shí)，可以得到1條182 bp的內(nèi)參條帶和1條135 bp的特異性條帶。DNA模板中只存在刺玫果DNA時(shí)，可以得到1條182 bp的內(nèi)參條帶和1條86 bp的特異性條帶。當(dāng)DNA模板中同時(shí)存在玫瑰果和刺玫果DNA時(shí)，可以得到1條182 bp的內(nèi)參條帶，1條135 bp的特異性條帶和1條86 bp的特異性條帶。

圖3 ARMS-PCR的P2設(shè)計(jì)示意圖

接表2

2.3 ARMS-PCR條件優(yōu)化

為從P1、P2和P3中篩選最佳的試驗(yàn)方案，使用玫瑰果和刺玫果果實(shí)BRM，通過(guò)DNA提取和PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，P1方案針對(duì)玫瑰果和刺玫果進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物一致，均為1條100 bp左右的條帶，P3方案針對(duì)玫瑰果和刺玫果均得到兩條200 bp左右的條帶，P1和P3方案均無(wú)法區(qū)分玫瑰果和刺玫果。P2方案針對(duì)玫瑰果可得到1條182 bp的內(nèi)參條帶和1條135 bp的特異性條帶，針對(duì)刺玫果可得到1條182 bp的內(nèi)參條帶和1條86 bp的特異性條帶，可明顯區(qū)分玫瑰果和刺玫果。結(jié)果表明P2方案優(yōu)于P1和P3方案，可以達(dá)到預(yù)期結(jié)果（圖4）。

圖4 3種設(shè)計(jì)的ARMS-PCR的驗(yàn)證結(jié)果

由于設(shè)計(jì)的4條引物的退火溫度不同，設(shè)計(jì)梯度PCR試驗(yàn)。從圖5（A）可以看出，最佳退火溫度為58℃。PCR的循環(huán)數(shù)決定擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量，循環(huán)數(shù)太多會(huì)易出現(xiàn)非特異條帶。為避免非特異性條帶干擾，分別測(cè)試25 cycles和28 cycles的擴(kuò)增效率，從圖5（B）可以看出，28 cycles和25 cycles均無(wú)非特異性條帶，但28 cycles電泳信號(hào)強(qiáng)度優(yōu)于25 cycles，表明28 cycles優(yōu)于25 cycles。

圖5 ARMS-PCR條件優(yōu)化

2.4 ARMS-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證ARMS-PCR玫瑰果鑒定的準(zhǔn)確性，通過(guò)雙盲試驗(yàn)測(cè)試玫瑰果市場(chǎng)樣品和刺玫果果實(shí)BRM，25個(gè)樣品經(jīng)DNA barcode技術(shù)進(jìn)行鑒定。ARMS-PCR結(jié)果表明（圖6），S-1，S-3，S-6，S-8，S-9，S-10，S-12，S-15，S-16，S-17，S-21，S-22，S-24，S-25這14個(gè)樣品被鑒定為刺玫果，S-2，S-4，S-5，S-7，S-11，S-13，S-14，S-18，S-19，S-20，S-23這11個(gè)樣品被鑒定為玫瑰果。該結(jié)果與DNA barcode方法結(jié)果完全一致?；赑OI統(tǒng)計(jì)分析，該測(cè)定對(duì)于鑒別玫瑰果和刺玫果果實(shí)原材料具有大于0.9（95%CI）的識(shí)別概率。

圖6 ARMS-PCR驗(yàn)證市場(chǎng)25批樣品

2.5 玫瑰果中刺玫果的最低檢測(cè)限確認(rèn)

為進(jìn)一步探索ARMS-PCR的檢出限，將玫瑰果和刺玫果BRM粉末按質(zhì)量比10/90，20/80，30/70，40/60，50/50，60/40，70/30，80/20和90/10進(jìn)行混合。從這些混合材料中提取DNA用于擴(kuò)增。結(jié)果顯示（圖7A），100%玫瑰果電泳結(jié)果僅有1條182 bp的內(nèi)參條帶和1條135 bp的特異性條帶，添加10%～90%刺玫果后，電泳結(jié)果顯示多1條86 bp的刺玫果特異性條帶，且隨著刺玫果添加量的升高，135 bp的玫瑰果特異性條帶強(qiáng)度降低。為確認(rèn)刺玫果的最低檢測(cè)限，對(duì)10%的刺玫果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果如圖7（B）所示。結(jié)果顯示，10次重復(fù)結(jié)果一致，均可檢出86 bp的刺玫果特異性條帶。綜上所述，該方法對(duì)玫瑰果中刺玫果的最低檢測(cè)限為10%。

圖7 ARMS-PCR最低檢測(cè)限測(cè)定

3 結(jié)論與討論

建立一種基于特征SNP位點(diǎn)的ARMS-PCR方法，并應(yīng)用于玫瑰果及其近緣種刺玫果的鑒定。該方法對(duì)玫瑰果和刺玫果的最低檢測(cè)限為10%。試驗(yàn)方法客觀、分辨率高。與DNA Barcode方法相比，檢測(cè)周期短，無(wú)需測(cè)序，結(jié)果以圖位差異的形式呈現(xiàn)，易于進(jìn)行判斷。

為確保目標(biāo)序列的擴(kuò)增和鑒定，高質(zhì)量DNA的獲取極為重要。植物材料中蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、多酚等物質(zhì)含量較高，這些物質(zhì)可能抑制PCR擴(kuò)增。因此，在DNA提取過(guò)程中盡可能地去除這些物質(zhì)非常重要。此外，植物的加工過(guò)程也會(huì)影響DNA的最終產(chǎn)量、純度以及完整性。

基于DNA技術(shù)的植物鑒定方法通常只能得到種屬、基因型等信息，而無(wú)法獲得植物中活性物質(zhì)的鑒定及定量信息。這些信息通常需要化學(xué)方法提供，如LC、LC-MS、GC-MS、NMR。在組學(xué)時(shí)代，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相輔相成，從而能夠?qū)Ω鞣N復(fù)雜的植物原料進(jìn)行全面鑒定。