聽花酒對大鼠性功能和外周血白細(xì)胞端粒長度的影響

倪子寒 許曉燕 李芳 余夢瑤

酗酒導(dǎo)致性功能損害和衰老，已得到廣泛認(rèn)可。在性功能研究方面，Van Thiel等早在20世紀(jì)80年代就總結(jié)認(rèn)為，慢性酒精濫用可損傷下丘腦-垂體-性腺功能，并進(jìn)一步損傷男性生殖功能。Peugh等總結(jié)前人研究資料認(rèn)為，急性大劑量飲酒和慢性酒精濫用會明確損傷男性性功能。過量飲酒對女性月經(jīng)周期、激素分泌、卵泡發(fā)育、子代發(fā)育都有不利影響。而在衰老研究方面，Dixit等研究認(rèn)為，酗酒能夠減少端粒長度。Topiwala等發(fā)現(xiàn)酒精和端粒長度之間存在潛在的閾值關(guān)系，過量飲酒會縮短端粒長度。

然而，適度飲酒對人體性功能和衰老的影響則存在較大爭議。例如，Cheng等和Chew的兩項(xiàng)回顧性研究認(rèn)為，少量到中等的慢性酒精飲用對男性ED有改善作用，而Maugeri等研究發(fā)現(xiàn)，在沒有酒精濫用和依賴的情況下，飲酒對端粒長度沒有影響。

聽花酒是以優(yōu)質(zhì)白酒為原酒，通過定向菌和特制香曲二次發(fā)酵、精餾濃縮等專有的白酒減害增益工藝釀制而成，具有同時(shí)激活交感與副交感神經(jīng)的雙激活作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，聽花酒對男性、女性性激素和血清NO含量有一定的改善作用。適度長期飲用聽花酒對人體性功能和衰老有何影響，目前尚未明確。本研究擬通過對大鼠交配行為、動情周期、血清激素水平、生殖器官臟器系數(shù)和組織病理、血清及主要性器官NO濃度和NOS活力及外周血白細(xì)胞端粒長度的影響研究，評價(jià)聽花酒對大鼠性功能和外周血白細(xì)胞端粒長度的作用。

一、材料

1.試驗(yàn)動物。雄性大鼠性功能和外周血白細(xì)胞端粒長度試驗(yàn)雄性SD大鼠，SPF級，48只，體重200-220g；雌性SD大鼠，SPF級，60只，體重180-200g，均購自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-19。

雌性大鼠性功能和外周血白細(xì)胞端粒長度試驗(yàn)采用雌性SD大鼠，SPF級，48只，體重220-240g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

以上動物均飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（川）2018-100）。

2.試驗(yàn)樣品與試劑。聽花酒（醬香風(fēng)格白酒，53°），宜賓聽花酒業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司提供，批號：20220309。聽花酒臨用前分別用蒸餾水稀釋4、8、16倍，密封置于4℃保存，72h內(nèi)使用完畢。醬香原酒（53°），宜賓聽花酒業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司提供，批號：20220322。醬香原酒臨用前用蒸餾水稀釋8倍，密封置于4℃保存，72h內(nèi)使用完畢。食用酒精（95%），購自成都市長聯(lián)化工試劑有限公司，批號：20211228。將食用酒精用蒸餾水稀釋至53%，密封置于4℃保存。臨用前取53%食用酒精以蒸餾水稀釋8倍，密封置于4℃保存，72h內(nèi)使用完畢。

苯甲酸雌二醇注射液（2mL：4mg），獸藥字：120032511，批號：20220201，購自合肥新科信動物藥業(yè)有限公司。黃體酮注射液（1mL：50mg），獸藥字：120031439，批號：20220201，購自合肥新科信動物藥業(yè)有限公司。

血清睪酮（T）ELISA試劑盒、促卵泡激素（FSH）ELISA試劑盒、黃體生成素（LH）ELISA試劑盒、雌二醇（E2）ELISA試劑盒、孕酮（P）ELISA試劑盒，購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。NO測定試劑盒、總一氧化氮合成酶（NOS）測試盒、總蛋白測定試劑盒、HE染液，購自南京建成生物工程研究所。DNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、DNA Marker，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、方法

1.動物分組與給藥。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，按體重隨機(jī)分為6組——正常組、食用酒精組、醬香原酒組、聽花高劑量組、聽花中劑量組、聽花低劑量組，每組8只。食用酒精組每日灌胃8倍稀釋的53%食用酒精，灌胃體積1mL/100g體重，相當(dāng)于每日飲用53%食用酒精1.25mL/kg。醬香原酒組每日灌胃8倍稀釋的醬香原酒，灌胃體積1mL/100g體重，相當(dāng)于每日飲用醬香原酒（53）1.25mL/kg。聽花高劑量組、聽花中劑量組、聽花低劑量組每日灌胃4倍、8倍、16倍稀釋的聽花酒，灌胃體積1mL/100g體重，分別相當(dāng)于每日飲用聽花酒（53）2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg。正常組灌胃蒸餾水，灌胃體積1mL/100g體重。各組動物均連續(xù)灌胃30d。

2.對雄性大鼠交配行為的影響。交配行為試驗(yàn)雌性動物的準(zhǔn)備：交配試驗(yàn)前14d，雌性大鼠腹腔注射350mg/kg水合氯醛麻醉，腹部兩側(cè)開口，分離兩側(cè)卵巢及子宮。結(jié)扎子宮末端后剪去卵巢，縫合創(chuàng)面。每只大鼠腹腔注射青霉素10萬U，連續(xù)3d。手術(shù)后自由飲食。交配行為試驗(yàn)前48h，每只雌性大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇40μg；交配行為試驗(yàn)前4h，每只雌性大鼠皮下注射黃體酮500μg，使之處于動情期。

給藥結(jié)束后當(dāng)日，在19：00-23：00時(shí)測定雄性大鼠的交配行為。實(shí)驗(yàn)室保持安靜，燈光要微弱、暗紅，將雄性大鼠單獨(dú)放入交配盒中5min以適應(yīng)環(huán)境，然后每盒放入處于動情期的雌性大鼠1只，觀察并記錄從雌鼠投入至雄鼠首次騎跨雌鼠的時(shí)間（騎跨潛伏期）、雄鼠首次插入的時(shí)間（插入潛伏期）、雄鼠首次射精的時(shí)間（射精潛伏期），以及騎跨次數(shù)、插入次數(shù)和射精次數(shù)。若大鼠未發(fā)生騎跨、插入、射精行為，則相應(yīng)行為潛伏期記為1200s。統(tǒng)計(jì)20min內(nèi)各組發(fā)生騎跨、插入、射精的動物數(shù)，計(jì)算騎跨百分率、插入百分率和射精百分率。

3.對雌性大鼠動情周期的影響。自給藥第17d起，每日兩次（8：00-9：00、20：00-21：00）對雌性大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢測，確定動情周期階段，連續(xù)14d。參考Hubscher等的方法進(jìn)行操作。將大鼠倒放在手掌上，用移液器吸取20μL生理鹽水，輕輕插入大鼠陰道，反復(fù)沖洗5下，吸出抽吸液并滴于載玻片上，涂片，在顯微鏡下觀察。動情周期階段判定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

4.對大鼠血清激素水平的影響。給樣結(jié)束后，大鼠以350mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，2000rpm離心10min，收集血清，-80℃下保存?zhèn)溆?。按相?yīng)ELISA試劑盒說明書操作流程，分別測定血清T、FSH、LH、E2、P激素水平。

5.對大鼠生殖器官臟器系數(shù)和組織病理的影響。大鼠采血后，解剖雄性大鼠陰莖、睪丸、附睪、前列腺、包皮腺、精囊腺和雌性大鼠陰道、卵巢、子宮并稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)（g/100g體重）=（臟器質(zhì)量/大鼠體重）×100。取左側(cè)睪丸、附睪、部分陰莖及前列腺、包皮腺、精囊腺和左側(cè)卵巢、子宮、部分陰道于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，HE染色，觀察組織病理形態(tài)。

6.對大鼠血清和主要性器官NO、NOS的影響。取右側(cè)睪丸、附睪及部分陰莖和右側(cè)卵巢、子宮及部分陰道，分別稱重后剪碎，加入9倍體積生理鹽水，于冰浴中勻漿，勻漿經(jīng)3000rpm離心10min，收集上清液。按試劑盒說明書測定大鼠血清和主要性器官組織勻漿上清液中NO含量和NOS活性。

7.對雄性大鼠陰莖組織cGMP含量的影響。取陰莖勻漿上清液，按ELISA試劑盒說明書操作流程，測定陰莖組織cGMP含量。

8.外周血白細(xì)胞端粒長度測定。按照DNA提取試劑盒說明書，提取大鼠血液DNA，用瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量，并計(jì)算濃度。參考Cawthon和Shoeb方法設(shè)計(jì)引物（表2）。熒光定量PCR反應(yīng)體系（50μL）為：2×SG Fast qPCR Master Mix 25μL，基因組DNA（20ng/μL）1μL，正向、反向引物（10μM）各2μL，超純水補(bǔ)足至50μL。端粒PCR條件為：預(yù)變性95℃ 3min，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)：95℃ 30s，54℃ 2min，72℃ 10s，循環(huán)完成后進(jìn)行熔解曲線分析。AT1 PCR條件為：預(yù)變性95℃ 3min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 10s，循環(huán)完成后進(jìn)行熔解曲線分析。PCR反應(yīng)完成后，采用icycler軟件計(jì)算各樣品Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法得出端粒相對長度。

三、結(jié)果

1.聽花酒對大鼠體重及一般狀態(tài)的影響。在所有時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠體重未見顯著性差異（P>0.05）。整個(gè)給藥過程中，除聽花高劑量組動物在第一周給藥后，出現(xiàn)自發(fā)活動減少、耳廓皮膚變紅等表現(xiàn)外，其余時(shí)間各組動物均未見一般狀態(tài)的異常改變。

2.聽花酒對雄性大鼠交配行為的影響。雄性大鼠交配行為試驗(yàn)結(jié)果顯示（表3），食用酒精組騎跨、插入、射精潛伏期均較正常組有較大幅度延長，但沒有顯著性差異（P>0.05）；騎跨、插入和射精次數(shù)較正常組減少，其中插入和射精次數(shù)具有顯著性差異（P<0.05）。與食用酒精組比較，聽花低劑量組和中劑量組騎跨、插入、射精潛伏期有一定幅度的縮短，但沒有顯著性差異（P>0.05）；插入和射精次數(shù)顯著增加，具有顯著性差異（P<0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與醬香原酒組相比，聽花中劑量組騎跨、插入、射精潛伏期有一定幅度的縮短，而騎跨、插入、射精次數(shù)有一定提高。

3.聽花酒對雌性大鼠動情周期的影響。觀察雌性各組動物的動情周期發(fā)現(xiàn)（表4），與正常組比較，食用酒精組動情前期、動情期、動情后期時(shí)間縮短，動情間期延長，但無顯著性差異（P>0.05）；與食用酒精組比較，聽花低、中、高劑量組動情前期、動情期均有所延長，而動情間期縮短，但無顯著性差異（P>0.05）。

4.聽花酒對大鼠血清激素水平的影響。雄性大鼠血清激素測定結(jié)果顯示（表5），食用酒精組T略有降低，聽花各劑量組T較食用酒精組均有所提高，但不具有顯著性差異（P>0.05）。同時(shí)，聽花低、中劑量組T較醬香原酒組也有所提高。雌性大鼠血清激素測定結(jié)果顯示（表6），聽花各劑量組T較正常組、食用酒精組、醬香原酒組均有一定提高，但不具有顯著性差異（P>0.05）。與醬香原酒比較，聽花各劑量組P有升高，聽花中、高劑量組的P高于正常組，聽花高劑量的E2高于正常組和酒精組，但不具有顯著性差異（P>0.05）。

5.聽花酒對大鼠生殖器官臟器系數(shù)和組織病理的影響。解剖發(fā)現(xiàn)，各組雌、雄大鼠的生殖器官質(zhì)地、色澤、大小等無明顯異常改變。比較臟器重量（表7、表9）和臟器系數(shù)（表8、表10）發(fā)現(xiàn)，雄性動物中，食用酒精組睪丸、附睪重量和系數(shù)較正常組有所減少，而前列腺重量和系數(shù)有所增加，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與食用酒精組比較，聽花中劑量組睪丸重量和系數(shù)有所增加，前列腺重量和系數(shù)有所降低，但未見顯著差異（P>0.05）。雌性動物中，與正常組比較，食用酒精組卵巢重量和系數(shù)有所減少，子宮、陰道重量和系數(shù)有所增加；與食用酒精組相比，聽花低、中、高劑量組卵巢重量和系數(shù)均有所增加，子宮、陰道重量和系數(shù)有所減少，但不具有顯著性差異（P>0.05）。

6.聽花酒對大鼠血清和主要性器官NO、NOS的影響。雄性動物NO、NOS測定結(jié)果顯示（表11、表12），食用酒精組陰莖勻漿中NO濃度較正常組有顯著降低（P<0.05），聽花酒低劑量組和中劑量組與食用酒精組相比陰莖勻漿中NO濃度升高，具有顯著性差異（P<0.05），同時(shí)聽花各劑量組陰莖NO均高于醬香原酒組。食用酒精組陰莖勻漿中NOS活性較正常組有顯著降低（P<0.05），聽花酒低劑量組和中劑量組與食用酒精組相比陰莖勻漿中NOS活性升高，其中小劑量組有極顯著差異（P<0.01），中劑量組有顯著性差異（P<0.05），兩者較醬香原酒組也有一定提升。

雌性動物NO、NOS測定結(jié)果顯示（表13、表14），聽花酒各劑量組陰道NO較食用酒精組和醬香原酒組都有一定提高，低、高劑量組NO含量高于正常組，但未見顯著性差異（P>0.05）。聽花酒各劑量組陰道NOS活性均較正常組、食用酒精組、醬香原酒組有所提高（P>0.05）。

7.聽花酒對雄性大鼠陰莖組織cGMP含量的影響。結(jié)果表明（表15），與正常組相比，食用酒精組陰莖勻漿中cGMP含量顯著降低（P<0.05），而聽花各劑量組陰莖勻漿中cGMP含量較食用酒精組有一定恢復(fù)，其中低劑量組與食用酒精組相比具有顯著性差異（P<0.05）。

8.聽花酒對大鼠外周血白細(xì)胞端粒長度的影響。根據(jù)表16、17可知，與正常組比較，食用酒精組外周血白細(xì)胞端粒相對長度大幅減少，雄性、雌性分別縮短11.88%和11.00%，但未見顯著性差異（P>0.05）。與正常組相比，聽花酒各劑量組端粒相對長度無明顯變化，但與食用酒精組相比，聽花酒各劑量組端粒相對長度有所恢復(fù)，雄性動物低、中、高劑量組分別較食用酒精組增加16.85%、13.48%、8.99%，雌性動物低、中、高劑量組分別較食用酒精組增加10.11%、11.23%、8.99%，但也未見顯著性差異（P>0.05）。

四、討論

酒可助性這句話，在古今中外的文化中有著廣泛的認(rèn)可度，但也一直受到大量質(zhì)疑。酗酒可導(dǎo)致性功能損害已獲得廣泛認(rèn)可，但適度飲酒對人體性功能的作用則存在爭議。一些研究認(rèn)為飲酒對性功能的復(fù)雜影響，可能與其在心理學(xué)和藥理學(xué)兩方面相互作用的結(jié)果相關(guān)。

聽花酒作為一種采用特有的減害增益工藝釀造的白酒，適量長期飲用對人體性功能有何作用，目前尚未研究。為此，本研究以不引起大鼠出現(xiàn)醉酒狀態(tài)的最大劑量2.5mL/kg為起點(diǎn)，采用2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg劑量連續(xù)灌胃雄性大鼠30d，通過測定對大鼠交配行為、動情周期、血清激素水平、生殖器官臟器系數(shù)和組織病理、血清及主要性器官NO濃度和NOS活力的影響，評價(jià)聽花酒對大鼠性功能的影響。

雄性大鼠交配行為結(jié)果顯示，食用酒精能夠顯著降低雄性大鼠插入和射精次數(shù)（P<0.05），并在一定程度上延長騎跨、插入、射精潛伏期，而聽花酒低、中劑量組與食用酒精組相比能夠顯著增加插入和射精次數(shù)（P<0.05），并縮短騎跨、插入、射精潛伏期，且與正常組相比無顯著性差異（P>0.05）。同時(shí)，與醬香原酒組相比，聽花中劑量組騎跨、插入、射精潛伏期有一定幅度的縮短，但騎跨、插入、射精次數(shù)有一定提高。以上結(jié)果表明，聽花酒不會引起在同等劑量食用酒精組中出現(xiàn)的性功能明顯下降，且與醬香原酒組表現(xiàn)相比也有一定提升。雌性大鼠動情周期結(jié)果顯示，與食用酒精組比較，聽花低、中、高劑量組動情前期、動情期均有延長趨勢，而動情間期有縮短趨勢，盡管無顯著性差異，但提示聽花酒可能減少食用酒精對雌性動情周期的影響。

睪酮是維持雄性性功能的最重要激素，也與女性性欲有密切關(guān)系。血清激素檢測發(fā)現(xiàn)，盡管未見顯著性差異，但在雄性和雌性大鼠中，聽花酒各劑量組T含量均較食用酒精組和醬香原酒組更高，甚至在雌性大鼠中高于正常組，提示聽花酒可能對食用酒精引起的T降低有恢復(fù)作用，且效果優(yōu)于醬香原酒。

生殖器官解剖和組織病理檢測發(fā)現(xiàn)，聽花酒對雄性和雌性生殖器官臟器系數(shù)和組織病理均無顯著影響（P>0.05），提示在本試驗(yàn)劑量和時(shí)間條件下，聽花酒不會引起大鼠生殖系統(tǒng)的明顯改變。

NO作為一種信號分子和一種活性氧物質(zhì)，在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要而復(fù)雜的生理作用和病理作用，被認(rèn)為是誘發(fā)陰莖平滑肌松弛和海綿體充盈產(chǎn)生勃起的主要物質(zhì)，此外還具有抑制血小板在血管內(nèi)皮表面聚集粘附的作用，防止陰莖勃起時(shí)海綿體血竇內(nèi)血栓的停滯。食用酒精能夠顯著降低雄性大鼠陰莖NO含量和NOS活性（P<0.05），而聽花低、中劑量組NO含量和NOS活性顯著高于食用酒精組（P<0.05），且與正常組相比沒有顯著差異（P>0.05），并優(yōu)于醬香原酒組。在陰道中，NO還對陰道血流的調(diào)節(jié)以及平滑肌的松弛起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管沒有顯著性差異，但聽花酒各劑量組雌性大鼠陰道NO含量和NOS活性較食用酒精組、醬香原酒組都更高，提示聽花酒在改善雌性陰道NO相關(guān)功能方面也具有有益作用。

NO/cGMP途徑是調(diào)控勃起功能的重要途徑之一，cGMP作為NO下游信號分子激活后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，食用酒精組陰莖勻漿中cGMP含量顯著降低（P<0.05），而聽花各劑量組陰莖勻漿中cGMP含量較食用酒精組有一定恢復(fù)，其中低劑量組與食用酒精組相比具有顯著性差異（P<0.05），并優(yōu)于醬香原酒組。

以上結(jié)果提示，聽花酒能夠避免食用酒精引起的陰莖NO含量下降和NOS活性降低，并且增強(qiáng)NO/cGMP途徑信號強(qiáng)度。

一些研究表明，酒精攝入量與死亡率之間存在U型曲線關(guān)系，適度飲酒與衰老的關(guān)系尚無定論。近年來，一些研究試圖利用端粒長度來評價(jià)適度飲酒與健康的關(guān)系。端粒是位于線性染色體末端的DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，具有維持基因組穩(wěn)定性的作用。由于真核生物DNA復(fù)制的固有機(jī)制，每次有絲分裂均會導(dǎo)致端?？s短，當(dāng)縮短到一定長度時(shí)，細(xì)胞即停止分裂進(jìn)入衰老狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞功能退化與凋亡。除與衰老相關(guān)以外，端粒還作為DNA損傷的分子信標(biāo)激活修復(fù)機(jī)制或在極端情況下啟動細(xì)胞死亡途徑。Topiwala等研究發(fā)現(xiàn)，酒精和端粒長度之間存在潛在的閾值關(guān)系，過量飲酒可能會縮短端粒長度。Maugeri等研究發(fā)現(xiàn)，在沒有酒精濫用和依賴的情況下，飲酒對端粒長度沒有影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，1.25mL/kg食用酒精連續(xù)灌胃雄性、雌性大鼠30d，可使其外周血白細(xì)胞端粒長度有較大幅度減少，而灌胃2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg聽花酒，動物外周血白細(xì)胞端粒長度較正常組無明顯變化，且較食用酒精組有所恢復(fù)。盡管以上結(jié)果雖未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但數(shù)據(jù)趨勢提示，食用酒精可能對大鼠外周血白細(xì)胞端粒相對長度有縮短作用，聽花酒中除乙醇外的其他發(fā)酵組分可能提高食用酒精所致端粒縮短作用的閾值，使端粒相對長度維持在與正常組相當(dāng)?shù)乃健?/p>

綜合上述研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，食用酒精能夠引起雄性大鼠交配行為變?nèi)?、陰莖NO含量降低和NOS活性下降等性功能不利改變，并表現(xiàn)出縮短外周血白細(xì)胞端粒長度趨勢，而聽花酒能夠避免食用酒精的上述不利影響，且部分指標(biāo)優(yōu)于醬香原酒，提示其在特殊的減害增益釀酒工藝中形成的某些活性物質(zhì)能夠拮抗乙醇對機(jī)體性功能和端粒長度的不利影響。飲酒對人體性功能的影響是神經(jīng)心理學(xué)和藥理學(xué)兩方面的綜合結(jié)果，本研究側(cè)重于從藥理學(xué)方面評價(jià)聽花酒的作用，可能與人體試驗(yàn)中包含神經(jīng)心理學(xué)和藥理學(xué)兩方面因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異，因此，聽花酒對人體性功能的研究還有待進(jìn)一步深入探索。而在衰老研究方面，適度飲用聽花酒更長的時(shí)間是否能夠延緩端粒磨損，或者聽花酒較普通白酒對端?？s短有更高的閾值，也是未來可以開展的研究內(nèi)容。