無患子皂苷對甜菜夜蛾的影響及其化學(xué)成分分析

胡榕 馬英姿 劉思思 陳景震 肖志紅 李昌珠

摘要 為明確無患子皂苷對甜菜夜蛾的控制作用，本試驗(yàn)分別用添加無患子皂苷（0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g）的混毒飼料喂養(yǎng)甜菜夜蛾 2齡幼蟲，測定甜菜夜蛾幼蟲存活率、幼蟲發(fā)育歷期、蛹重、化蛹率、卵孵化率、性比等指標(biāo)。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）分析無患子皂苷中的主要化學(xué)成分。結(jié)果表明，喂飼后72 h，取食4 mg/g混皂苷飼料的甜菜夜蛾幼蟲開始死亡，其幼蟲存活率隨皂苷濃度的升高而降低;相比空白對照組，取食4 mg/g混皂苷飼料的幼蟲，其幼蟲期延長8.55 d（P＜0.05），蛹重降低了41.13%（P＜0.05），化蛹率下降46.43%（P＜0.05）。取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷飼料的幼蟲其卵孵化率分別比空白對照降低9.61%、16.12%;取食混有皂苷的飼料會擾亂甜菜夜蛾的性比，其中混入2 mg/g皂苷的處理對其性比影響最大，雌性比為25.00%。從無患子皂苷中鑒定出10種皂苷類化合物，共鑒別出6種常春藤型三萜皂苷，3種齊墩果酸型三萜皂苷，1種大戟烷型三萜皂苷。

關(guān)鍵詞 甜菜夜蛾;?生長發(fā)育;?繁殖;?無患子皂苷;?化學(xué)成分

中圖分類號： S 433.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021730

Abstract In order to clarify the control effect of Sapindus saponin on Spodoptera exigua， the 2nd instar larvae of S.exigua were fed with the feed mixed with seven different concentrations （0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8 and 16 mg/g） of Sapindus saponin. The larval survival rate， larval developmental duration， pupal weight， pupation rate， egg hatching rate and sex ratio of S.exigua were measured. The main chemical components of Sapindus saponin were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）. The results showed that the death of larvae began to appear at 72 h after feeding with 4 mg/g saponin and the survival rate of larvae decreased with increasing concentration of saponin. The larval stage prolonged by 8.55 d; the pupal weight was significantly decreased by 41.13%， and the pupation rate was significantly decreased by 46.43 compared with the control group. The egg hatching rate decreased by 9.61% and 16.12%， respectively， compared with the control group when fed with 0.5 mg/g or 2 mg/g saponin. The moth sex ratio was biased by feeding saponin， and 2 mg/g saponin had the greatest impact on the sex ratio， with a female to male ratio of 25.00%. Ten saponins were identified from Sapindus， including six ivy-type triterpenoid saponins， three oleanolic acid-type triterpene saponins， and one euphorbia-type triterpene saponin.

Key words Spodoptera exigua;?growth and development;?reproduction;?Sapindus saponin;?chemical composition

甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）是一種世界范圍內(nèi)的重要農(nóng)業(yè)害蟲［1］，威脅許多經(jīng)濟(jì)作物，如棉花、玉米、煙草等的生產(chǎn)，造成經(jīng)濟(jì)損失。其通過遷徙越冬而不滯育。在過去的20年里，化學(xué)殺蟲劑是控制該害蟲最有效的手段，包括一些傳統(tǒng)的有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和苯甲酰脲類殺蟲劑［2］，但隨著這類化學(xué)殺蟲劑長期的不合理使用，甜菜夜蛾已對一些藥劑產(chǎn)生了高度抗性，且引發(fā)了農(nóng)藥殘留以及環(huán)境污染等一系列問題［3］。因而，尋求一種無污染的生物防治方法已經(jīng)成為全世界的重點(diǎn)研究課題之一。植物源殺蟲劑具有低毒、低殘留、選擇范圍大、可延緩害蟲抗藥性、開發(fā)污染小等特點(diǎn)［4-5］，近年來得到廣泛關(guān)注。

無患子Sapindus saponaria為無患子科Sapindaceae無患子屬Sapindus落葉喬木，又名木患子、肥皂樹、洗手果等，主要生長在東南亞各國以及我國的長江流域，分布于淮河以南各地［6-7］，無患子是一種綜合利用價(jià)值較高的經(jīng)濟(jì)樹種，其假種皮中含有大量皂苷成分。目前有關(guān)無患子皂苷抗菌、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管及肝臟、殺蟲等方面的研究已有一些報(bào)道［8］。據(jù)報(bào)道無患子皂苷對小管福壽螺Pomacea canaliculata、斜紋夜蛾 Spodoptera litura、弧金翅夜蛾Thysanoplusia orichalcea等均有較好的抑制作用［9-11］。鑒此，本文研究了無患子皂苷提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的影響，旨在為將無患子皂苷開發(fā)成低毒、高效的植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1?材料與方法

1.1?材料

供試無患子采于湖南省瀏陽市普跡鎮(zhèn)。甜菜夜蛾幼蟲及人工飼料均購買自科云生物技術(shù)有限公司，幼蟲使用人工飼料飼養(yǎng)，成蟲用5%蜂蜜水飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（26±2）℃，相對濕度（70±2）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2?方法

1.2.1?無患子皂苷提取液的制備

無患子皂苷的提取方法主要包括水提法或有機(jī)溶劑提取法。水提法的提取率較高，且成本較低，適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此本試驗(yàn)采用水提法提取，具體操作參照方譯晨［12］的方法。無患子果皮中的三萜皂苷主要是齊墩果酸型，因此本試驗(yàn)以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對照［13］。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購自索萊寶生物科技有限公司。以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光度值為縱坐標(biāo)（y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.672 5x+0.050 1，R2=0.999 6。采用紫外-可見分光光度計(jì)測定無患子皂苷含量［14］。

1.2.2?無患子皂苷對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的影響

參照李秀梅等［15］的飼料混毒法。將無患子皂苷提取液用蒸餾水稀釋成1、2、4、8、16、32、64 mg/mL的試驗(yàn)濃度，取5 mL藥液與20 g人工飼料充分混勻，配制成含0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g無患子皂苷的混毒人工飼料，并設(shè)蒸餾水為空白對照。在24孔養(yǎng)蟲板中加入混毒飼料，每孔分別接入1頭生長狀態(tài)良好，大小一致的甜菜夜蛾2齡幼蟲，在溫度（26±2）℃，相對濕度（70±2）%， 光周期L∥D=14 h∥10 h的智能人工氣候箱中飼養(yǎng)，每個(gè)濃度處理20頭，3次重復(fù)。人工飼料保持新鮮，以確保幼蟲正常生長［16］。每隔24 h清除糞便及殘留垃圾，統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡率、化蛹率、幼蟲歷期等數(shù)據(jù)，記錄至幼蟲全部死亡或化蛹為止［17］，幼蟲化蛹后稱量蛹重。幼蟲死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)為輕觸試蟲蟲體，蟲體不能自主運(yùn)動者視為死亡。待蛹羽化后，記錄羽化的雌雄成蟲數(shù)量。挑選１雌１雄進(jìn)行配對（共10對），放入成蟲飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng)，盒中放入浸潤10％蜂蜜水的脫脂棉球供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)（每天補(bǔ)充清水保持棉球濕潤）。每天定時(shí)觀察記錄盒內(nèi)壁雌蟲的產(chǎn)卵情況以及卵的孵化情況［18］。

1.3?化學(xué)成分分析

無患子皂苷的化學(xué)組分采用 HPLC-MS法分析和鑒定。色譜柱：沃特世ACQUITY UPLC HSS T3 （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）;流動相A：0.1%甲酸水溶液;流動相B：0.1%甲酸乙腈;柱溫：50℃;進(jìn)樣量：3 μL;梯度洗脫：起始時(shí)95%A，5%B; 10 min 時(shí)70%A，30%B; 32 min時(shí)40%A，60%B;37 min時(shí)5%A，95%B;38 min時(shí)95%A%， 5%B;流速：0.3 mL/min;檢測波長：254 nm。MS條件如下：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀：正負(fù)離子掃描模式;掃描范圍：100～1 500 m/z;霧化氣（GS1）：50 psi;霧化氣（GS2）：50 psi;氣簾氣（CUR）：35 psi;離子源溫度（TEM）：600℃（正）和550℃（負(fù)）;離子源電壓（IS）： 5 500 V（正）和-4 500 V（負(fù)）;一級掃描：去簇電壓（DP）：100 V;聚焦電壓（CE）：10 V;二級掃描：使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為±40 V和±20 V，進(jìn)樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2 mg/kg。各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫，確定無患子皂苷中的化合物結(jié)構(gòu)。

1.4?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

化蛹率=化蛹蟲數(shù)/試驗(yàn)總蟲數(shù)×100%［19］;

羽化率=羽化蟲數(shù)/化蛹蟲數(shù)×100%［19］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 26.0軟件處理。存活率、羽化率、化蛹率，性比和卵孵化率等百分比數(shù)據(jù)首先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換。不同無患子皂苷處理下甜菜夜蛾適合度參數(shù)用Kolmogorov-Smirnov測驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過Kruskal-Wallis測驗(yàn)（α=0.05）進(jìn)行比較。正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過單因素方差分析（One-way ANOVA） 進(jìn)行分析（α=0.05），平均數(shù)采用LSD法進(jìn)行多重比較［20］。

2?結(jié)果與分析

2.1?無患子皂苷對甜菜夜蛾發(fā)育以及性比的影響

由表1可知，無患子皂苷對甜菜夜蛾的幼蟲存活率、化蛹率、羽化率、卵孵化率以及雌性比均存在不同程度的影響，其中對甜菜夜蛾幼蟲存活率以及化蛹率影響較大，對甜菜夜蛾的羽化率、卵孵化率以及雌性比影響較小。藥后72 h，當(dāng)添加的皂苷濃度達(dá)到4 mg/g及以上時(shí)幼蟲出現(xiàn)死亡，且無患子皂苷濃度越高，幼蟲存活率越低。與空白對照組相比，添加4 mg/g皂苷時(shí)，化蛹率降低46.43%（P＜0.05）;取食0.25 mg/g和1 mg/g混皂苷飼料后羽化率分別降低18.06%和11.43%;取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷飼料后卵孵化率分別降低9.61%、16.12%。取食混有無患子皂苷的飼料會擾亂甜菜夜蛾的雌性比，其中取食混有2 mg/g皂苷的處理其雌性比明顯降低，為25.00%。

2.2?無患子皂苷對甜菜夜蛾幼蟲期和蛹期的影響

無患子皂苷對甜菜夜蛾幼蟲期有顯著影響，混皂苷飼料中無患子皂苷濃度越高，對幼蟲發(fā)育的抑制作用越明顯（表2）。4 mg/g混皂苷飼料處理下的幼蟲期（17.57 d）比空白對照組延長8.55 d（P＜0.05）。無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹期有一定程度的影響，但蛹期與無患子皂苷濃度沒有明顯相關(guān)性，其中0.5 mg/g混皂苷飼料處理下的蛹期最長，與空白組相比，蛹期延長2.97 d。

2.3?無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹重的影響

無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹重有顯著影響（圖1），且濃度越高抑制作用越顯著?；旌?.5～4 mg/g皂苷處理組的蛹重均顯著低于空白對照，其中混4 mg/g皂苷飼料處理下的蛹重最小，為0.120 1 g，相比空白組減輕了0.083 9 g。0.25、0.5、1、2 mg/g混皂苷處理甜菜夜蛾的蛹重比空白對照組依次減輕0.011 7、0.035 8、0.047 0、0.077 0 g。

2.4?無患子皂苷成分分析

無患子皂苷提取物其化學(xué)成分見表3。結(jié)合高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合分子式，在 Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫中檢索，對無患子果皮中皂苷類成分進(jìn)行快速篩查和鑒別，共鑒別出10種皂苷類物質(zhì)，含有五環(huán)三萜皂苷類齊墩果烷型皂苷、四環(huán)三萜類大戟烷型皂苷。不同種類的無患子皂苷的主要區(qū)別在于其骨架結(jié)構(gòu)、糖的種類、連接順序和連接位置等不同，其中糖的種類主要為葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等。根據(jù)常春藤型皂苷元m/z（471/393），齊墩果酸m/z（455/407）等特征碎片離子［21］，對無患子果皮中該類成分進(jìn)行快速篩查和鑒別，共鑒別出6種常春藤型三萜皂苷，3種齊墩果酸型三萜皂苷，1種大戟烷型三萜皂苷。

3?結(jié)論與討論

一般來說，植物源殺蟲劑不會直接殺死害蟲，但會使害蟲在接觸殺蟲劑后產(chǎn)生拒食反應(yīng)，停止取食或顯著減少取食量，導(dǎo)致其不能蛻皮進(jìn)入到下一齡期，幼蟲處于瀕臨死亡狀態(tài)，最后部分害蟲死亡［22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無患子皂苷對甜菜夜蛾的生長發(fā)育及繁殖的抑制作用是多方面的，主要包括直接“殺死”害蟲、顯著抑制幼蟲蛻皮、降低害蟲蛹重、延長害蟲幼蟲期和蛹期等方面，以此來控制害蟲群體增長速度和種群數(shù)量。甜菜夜蛾幼蟲取食不同濃度無患子皂苷提取物后，其幼蟲期延長，可能是因?yàn)樵碥仗崛∫菏固鸩艘苟戤a(chǎn)生拒食現(xiàn)象，導(dǎo)致食物攝入不足，沒有足夠營養(yǎng)支撐而無法進(jìn)入下一個(gè)蛻皮階段［23］；或因取食皂苷提取物后其消化系統(tǒng)受損，影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收；或因有毒化合物破壞了甜菜夜蛾體內(nèi)激素平衡，導(dǎo)致其產(chǎn)生畸形蟲態(tài)［24］。本研究有個(gè)別幼蟲取食無患子皂苷提取液后出現(xiàn)延遲蛻皮，遲遲不能進(jìn)入下一階段的情況，推測是幼蟲體內(nèi)激素水平失衡，導(dǎo)致幼蟲活力降低，出現(xiàn)畸形蟲，相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

植物提取液對昆蟲繁殖力有一定的抑制作用，這在當(dāng)歸和蓖麻乙醇提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的亞致死效應(yīng)的研究中已有報(bào)道［24］。本研究中出現(xiàn)部分卵不能正常孵化以及個(gè)別雌蟲所產(chǎn)卵全部不能孵化的情況。推測可能是因?yàn)闊o患子皂苷通過影響昆蟲的內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及昆蟲體內(nèi)相關(guān)酶系，致使成蟲性腺發(fā)育成熟能力下降，生殖能力減退。具體表現(xiàn)為雄蟲不易產(chǎn)生精子或精子形成后失去活力，雌蟲產(chǎn)卵量下降或所產(chǎn)卵多為未受精的無效卵。

有多項(xiàng)研究證實(shí)皂苷類物質(zhì)具有抗蟲活性。如錄麗平等［25］研究發(fā)現(xiàn)無患子中的皂苷對小菜蛾P(guān)lutella xylostella （Linnaeus）和果蠅Drosophila具有毒殺活性。Huang等［9］從無患子水提物中分離出的常春藤型三萜皂苷Mukurozi-saponin G、Mukurozi-saponin E1對福壽螺具有顯著的殺螺活性，致死率高達(dá)70%～100%。另外，Upadhyay等［26］也指出無患子提取物可以抑制椎實(shí)螺Lymnaea acuminata神經(jīng)組織中的乙酰膽堿酯酶（AchE）、酸性和堿性磷酸酶（ACP/ALP），從而使螺死亡。因此，三萜皂苷是無患子果皮中具有極大利用價(jià)值的一類皂苷，可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步開發(fā)利用。

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）從無患子皂苷提取物中鑒定到大量的三萜皂苷和倍半萜皂苷，由此推測無患子皂苷中抑制甜菜夜蛾生長發(fā)育及繁殖的活性物質(zhì)可能是無患子皂苷中的三萜類化合物或者是倍半萜類化合物。具體是哪種成分或者哪幾種成分協(xié)同作用，以及以哪種方式起作用，作用機(jī)理等還有待進(jìn)一步深入探究。進(jìn)一步研究無患子皂苷對農(nóng)田害蟲的生物活性并對其活性成分進(jìn)行分離純化及鑒定，對合成和開發(fā)新型植物源農(nóng)藥和對指導(dǎo)無公害蔬菜生產(chǎn)都有重要意義。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）