鹿茸菇母種培養(yǎng)基條件優(yōu)化及其菌絲顯微觀察

陳華 黃彩翔 郭月仙 林怡 王義祥 劉朋虎

摘 要：為進(jìn)一步了解鹿茸菇的生物學(xué)特性，篩選其適宜的母種培養(yǎng)基配方，設(shè)置了不同碳源、氮源、pH和溫度條件的篩選試驗(yàn)，觀測(cè)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)情況和菌絲顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：鹿茸菇母種培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最適碳源為淀粉，最適氮源為硝酸鈉，最適pH值為7.0，最適菌絲生長(zhǎng)溫度為25℃，鹿茸菇菌絲為雙核細(xì)胞，有鎖狀聯(lián)合，其細(xì)胞較長(zhǎng)，不同生長(zhǎng)時(shí)期隔膜明顯度不同。

關(guān)鍵詞：鹿茸菇；母種培養(yǎng)基；細(xì)胞核；顯微觀察

中圖分類號(hào)：S 646.9? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）02-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.004

Abstract： In order to further understand the biological characteristics of Lyophyllum decastes and select the appropriate formula of mother culture medium， the screening tests of different carbon sources， nitrogen sources， pH and temperature conditions were set up to observe the mycelial growth and microstructure of Lyophyllum decastes. The results showed that the optimum carbon source was starch， the optimum nitrogen source was sodium nitrate， the optimum pH was 7.0， and the optimum temperature for the mycelial growth was 25℃. The mycelium of Lyophyllum decastes was a binuclear cell with clamp connection. Its cells were longer， and the visibility of cell membrane was different at different growth stages.

Key words： Lyophyllum decastes； Mother culture medium； Cellular nuclear； Microscopic observation

鹿茸菇學(xué)名為荷葉離褶傘Lyophyllum decastes，因其外形與鹿茸相似，故取名鹿茸菇[1]。鹿茸菇肉質(zhì)厚實(shí)、口感脆滑，具有很高的食用和藥用價(jià)值，可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[2]，降低血糖、血壓等[3]，具有很好的應(yīng)用前景。20世紀(jì)90年代日本首次室內(nèi)栽培鹿茸菇，從2000年開始大量生產(chǎn)，2004年在日本寶酒造株式會(huì)社首次實(shí)現(xiàn)無(wú)覆土栽培[1]。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者先后對(duì)野生荷葉離褶傘子實(shí)體進(jìn)行分離、人工馴化。1973年李植森曾利用蕨臺(tái)和茅草為培養(yǎng)料在林地內(nèi)仿野生栽培研究[4]；2005年李林玉等[5]也對(duì)荷葉離褶傘菌絲營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了初步研究；2006年魏生龍等[6]利用PDA培養(yǎng)基上獲得了其子實(shí)體；2007年上海豐科生物科技股份公司首次在中國(guó)成功實(shí)現(xiàn)了荷葉離褶傘菌（FLd1）的工廠化栽培[7]，但還存在著發(fā)菌期較長(zhǎng)、單瓶產(chǎn)量偏低的缺點(diǎn)。之后，隨著工廠化栽培技術(shù)的成功發(fā)展和管理技術(shù)的逐漸成熟，鹿茸菇產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)。但由于鹿茸菇菌種難以維持，菌種迅速退化，導(dǎo)致栽培產(chǎn)量下降。此外，由于不同來源的鹿茸菇菌株其生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)速度有所差異，為了縮短鹿茸菇菌株的菌絲生長(zhǎng)周期，提高鹿茸菇工廠化生產(chǎn)水平，探索其適宜培養(yǎng)條件，縮短栽培周期，提高栽培產(chǎn)量仍是未來研究的重點(diǎn)。為此，本研究通過對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)最適碳源、氮源、pH和溫度等條件篩選以及菌絲顯微觀察展開研究，旨在明確鹿茸菇的生物學(xué)特性和其工廠化栽培技術(shù)的優(yōu)化提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試鹿茸菇菌株為L(zhǎng)yophyllum decastes LRX，來自寧德市益智源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 PDA培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯40 g、蔗糖4 g、NaNO3 0.2 g和瓊脂4 g。

1.2.2 碳源配方篩選 試驗(yàn)共選取7種碳源，分別為麥芽糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、紅糖、白糖和果糖。試驗(yàn)時(shí)配制含20 g·L-1的7種碳源PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別分裝于試管中，并盡量使裝入的培養(yǎng)基液面保持相同高度，從而得到相同長(zhǎng)度的培養(yǎng)斜面。121℃下高壓蒸汽滅菌20 min，然后擺斜面。冷卻后將活化好的母種菌絲，以相等的接種量接種到不同碳源斜面培養(yǎng)基上，每種碳源接5根試管，做好標(biāo)記。25℃下恒溫、避光培養(yǎng)復(fù)蘇，待菌絲在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后，同一天給不同碳源畫一條基準(zhǔn)線，繼續(xù)培養(yǎng)20 d，期間每隔5 d畫一次線，觀察和記錄這20 d的生長(zhǎng)情況，包括長(zhǎng)勢(shì)、色澤、平均生長(zhǎng)速度，比較不同碳源的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 氮源配方篩選 氮源配方篩選是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1 g·L-1的酵母粉、牛肉浸膏、谷氨酸、NH4Cl、NaNO3作為氮源，每種氮源重復(fù)5次。參照1.2.2進(jìn)行接種和生長(zhǎng)情況觀察。

1.2.4 最適pH篩選 試驗(yàn)共設(shè)pH4、5、6、7、8和9等6個(gè)水平，每個(gè)處理重復(fù)5次。試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用的碳源、氮源分別為蔗糖和NaNO3。利用1 mol·L-1 NaOH或1 mol·L-1 HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至相應(yīng)的pH條件，然后參照1.2.2的方法進(jìn)行接種和生長(zhǎng)情況觀察。

1.2.5 最適溫度篩選 試驗(yàn)設(shè)19℃、22℃、25℃、28℃、29℃、30℃和31℃等7個(gè)溫度條件，基礎(chǔ)培養(yǎng)基同pH篩選試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)5次。接種后分別放在不同溫度的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待復(fù)蘇后對(duì)不同溫度培養(yǎng)下的菌絲在同1 d畫一條基準(zhǔn)線，繼續(xù)培養(yǎng)20 d，期間每隔5 d畫一次線，記錄20 d的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)情況。

1.2.6 菌絲細(xì)胞核數(shù)量觀察 將鹿茸菇菌種接種在插有蓋玻片的平板培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)，待菌絲爬上蓋玻片的1/3面積后，即可通過DAPI染料染色，然后在正置熒光顯微鏡下觀察菌絲的細(xì)胞核數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0軟件中Duncan多重性方法分析不同處理間的差異顯著性，數(shù)據(jù)均為5個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（平均值±SD，n=5，顯著P<0.05，極顯著P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1、圖1可知，鹿茸菇菌絲對(duì)8種碳源均能利用，菌絲均呈現(xiàn)出稠密，潔白，但也存在一定的差異。不同碳源對(duì)鹿茸菇菌絲的生長(zhǎng)速度影響不同，依次為麥芽糖>淀粉>玉米粉>蔗糖>葡萄糖>白糖>紅糖>果糖。麥芽糖作為碳源菌絲生長(zhǎng)速度最快，但菌絲的稠密度不及淀粉；淀粉作為碳源菌絲生長(zhǎng)速度第2，但從菌絲的生長(zhǎng)稠密程度上看是最密的，麥芽糖與淀粉作為碳源菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著；玉米粉作為碳源菌絲的生長(zhǎng)速度較快，但菌絲生長(zhǎng)較稀疏；蔗糖、葡萄糖、白糖、紅糖作為碳源菌絲的生長(zhǎng)速度差異不顯著；果糖作為碳源菌絲的生長(zhǎng)速度最慢。綜上，淀粉作為碳源對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)是最佳的。

2.2 氮源對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2、圖2可知，鹿茸菇菌絲對(duì)NaNO3、牛肉浸膏、酵母粉、谷氨酸、NH4Cl這5種氮源都能利用，菌絲生長(zhǎng)速度依次為NaNO3>牛肉浸膏>酵母粉>谷氨酸>NH4Cl。從菌絲的疏密程度上看，以NaNO3為氮源菌絲最密；牛肉浸膏和酵母粉為氮源菌絲的疏密程度比NaNO3稍差；以谷氨酸、NH4Cl為氮源的菌絲生長(zhǎng)緩慢，但菌絲較為密集。NaNO3、牛肉浸膏作為氮源菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于其他3種，綜合菌絲生長(zhǎng)速度和疏密程度，NaNO3作為氮源對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)是最佳的。

2.3 pH對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3、圖3可知，鹿茸姑菌絲在pH值為4、5、6、7、8、9的培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，其中pH值為7時(shí)生長(zhǎng)速度最快，菌絲生長(zhǎng)濃密，潔白，棉絮狀，整齊，不往試管壁上生長(zhǎng)；pH值為6時(shí)菌絲生長(zhǎng)濃密，潔白，棉絮狀，向試管壁上生長(zhǎng)嚴(yán)重；pH值為8時(shí)菌絲生長(zhǎng)較為濃密，潔白，棉絮狀，較整齊，菌絲向試管壁上生長(zhǎng)較嚴(yán)重；pH值為9時(shí)菌絲生長(zhǎng)濃密，潔白，棉絮狀，整齊，菌絲往試管壁上生長(zhǎng)的程度較輕；pH值為5時(shí)菌絲生長(zhǎng)較稀疏，白色，棉絮狀但不是很明顯，往試管壁上生長(zhǎng)的程度較輕；pH值為4時(shí)由于培養(yǎng)基凝固程度不高，菌絲生長(zhǎng)稀疏，白色，往試管壁上生長(zhǎng)嚴(yán)重。綜上，培養(yǎng)基pH值為7時(shí)最適鹿茸姑菌絲生長(zhǎng)。

2.4 溫度對(duì)鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4、圖4可知，鹿茸菇菌絲在供試溫度中，生長(zhǎng)狀況最好的是25℃，致死溫度是31℃ ，該品種鹿茸菇不適宜超過29℃的高溫下生長(zhǎng)。25℃下菌絲生長(zhǎng)速度最快，且菌絲濃密；22℃下菌絲生長(zhǎng)速度比25℃下的生長(zhǎng)速度慢，菌絲濃密；19℃下菌絲生長(zhǎng)速度比22℃下的生長(zhǎng)速度慢，且其菌絲的濃密程度也比不過22℃下生長(zhǎng)的菌絲濃密；菌絲在28℃下的生長(zhǎng)速度明顯有所下降，但菌絲生長(zhǎng)仍濃密；29℃和30℃下生長(zhǎng)的菌絲，前期能夠萌發(fā)生長(zhǎng)，但10 d后可以明顯地看到接種塊有些發(fā)黃，菌絲生長(zhǎng)速度緩慢。

2.5 鹿茸菇菌絲細(xì)胞核數(shù)量觀察

菌絲是食用菌的營(yíng)養(yǎng)器官，通過分解吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分、無(wú)機(jī)鹽類和有機(jī)物質(zhì)等供給自己生長(zhǎng)發(fā)育。菌絲細(xì)胞又是食用菌的基本組成單位，也是菌種鑒別的重要參考依據(jù)。由圖5可知，鹿茸菇菌絲是雙核細(xì)胞，有鎖狀聯(lián)合，其細(xì)胞較長(zhǎng)，不同生長(zhǎng)時(shí)期隔膜明顯度不同。通過5 ug·mL-1 DAPI染料染色，在正置熒光顯微鏡40倍物鏡下觀察菌絲的染色情況，可以在目鏡中看到細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色至淺綠色熒光，有時(shí)會(huì)發(fā)黃色熒光，原因是稀釋DAPI染料的磷酸鹽緩沖液會(huì)隨DAPI染料進(jìn)入菌絲細(xì)胞中，細(xì)胞中的多聚磷酸顆粒與DAPI結(jié)合，在紫外激發(fā)光下會(huì)發(fā)黃色熒光。

3 討論與結(jié)論

碳源、氮源、pH和溫度等均是食用菌菌絲生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)因子，為了簡(jiǎn)化配方篩選指標(biāo)，大多研究者選擇碳氮比作為配方篩選的關(guān)鍵因子進(jìn)行研究，易忽略pH和溫度指標(biāo)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。鹿茸菇栽培起步晚，栽培技術(shù)不夠完善，生物學(xué)特性研究不夠健全，需要進(jìn)一步加大基礎(chǔ)性指標(biāo)研究。因此，通過碳源、氮源、pH和溫度等生長(zhǎng)因子的篩選對(duì)基礎(chǔ)研究具有重要參考價(jià)值。本試驗(yàn)從碳源配方篩選中得出，麥芽糖配方菌絲生長(zhǎng)速度最快，淀粉配方第2與麥芽糖配方菌絲長(zhǎng)速無(wú)顯著差異，但淀粉配方菌絲色澤和長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于麥芽糖配方。有研究表明，淀粉作為碳源添加于培養(yǎng)基中，對(duì)榆干離褶傘、羊肚菌和杏鮑菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)發(fā)揮重要作用[8-10]。從氮源配方篩選中得出，鹿茸菇菌絲對(duì)有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮均能利用，結(jié)果表明無(wú)機(jī)氮NaNO3更適合鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)，有機(jī)氮中牛肉浸膏菌絲生長(zhǎng)效果最好。周會(huì)明等[11]對(duì)荷葉離褶傘配方篩選表明，菌株ZY01、ZY02及ZY03的最適碳源是蔗糖，最適氮源是蛋白胨，而菌株ZY04和ZY05最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨。說明不同菌株對(duì)碳源和氮源的需求具有差異性。鹿茸菇屬中溫型菌類，菌絲在19～30℃下均能生長(zhǎng)，且隨著溫度的提高，生長(zhǎng)速度出現(xiàn)“低促高抑”趨勢(shì)，25℃下菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲色澤潔白，長(zhǎng)勢(shì)最密；在31℃下培養(yǎng)，菌絲停止生長(zhǎng)。pH在6～8范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，pH為7時(shí)是最佳酸堿度。鹿茸菇菌絲生長(zhǎng)溫度與張凌姍[12]的研究較為一致，而pH略有差異。

在觀察鹿茸菇菌絲細(xì)胞核過程中，其菌絲生長(zhǎng)時(shí)間會(huì)影響到觀察結(jié)果，一般培養(yǎng)10 d左右為宜。觀察時(shí)盡量將視野移動(dòng)到菌絲尖端位置，由于菌絲尖端分裂旺盛，更可能觀察到完整細(xì)胞和里面的細(xì)胞核。另外，在利用正置熒光顯微鏡觀察時(shí)，每次使用的時(shí)間需控制在1～2 h，因?yàn)槌^90 min后，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降，發(fā)出的熒光減弱。同時(shí)，標(biāo)本局部受到紫外線照射3～5 min后，熒光也會(huì)明顯減弱，需要不停地移動(dòng)觀察。整個(gè)標(biāo)本的觀察時(shí)間在40 min左右熒光會(huì)淬滅。不同濃度的DAPI染料，其穿透性不同，因此需要根據(jù)不同樣本選擇不同的濃度，染色出來的熒光才清晰。食用菌菌絲具有鎖狀聯(lián)合，都可以判斷為雙核菌絲，但并不是所有的雙核菌絲一定具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)[13]。本研究通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鹿茸菇菌絲屬于雙核菌絲，并有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)發(fā)生，一方面為工廠化栽培鹿茸菇奠定了理論基礎(chǔ)，另一方面豐富了鹿茸菇生物學(xué)特性及開展雜交育種、優(yōu)良菌株篩選提供參考。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）