基于miR-378探討丹紅注射液干預(yù)壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠心肌纖維化機(jī)制

熊霞軍 胡思遠(yuǎn) 鐘森杰 張倩 范星宇 胡志希

〔摘要〕 目的 探討丹紅注射液對(duì)壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用與機(jī)制。方法 取50只大鼠并對(duì)其行主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction， TAC），造模9周后將其隨機(jī)分為模型（TAC）組、丹紅注射液（DH）組（6.0 mL·kg-1）、卡托普利（Captopril）組（8.8 mg·kg-1），另設(shè)立10只為假手術(shù)（Sham）組。藥物干預(yù)15 d后對(duì)各組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide， NT-pro BNP）含量；HE、Masson染色觀察心肌病理學(xué)及纖維化改變，Western blot檢測(cè)心肌組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-1， COL-1）、Ⅲ型膠原蛋白（collagen-3， COL-3）及α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）表達(dá)；qRT-PCR 檢測(cè)心肌組織中miR-378、TGF-β1 mRNA、Col-1 mRNA、Col-3 mRNA、ɑ-SMA mRNA表達(dá)。結(jié)果 與Sham組比較，TAC組左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）、心肌組織miR-378下降，左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension， LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter， LVESD）、血漿NT-pro BNP、TGF-β1、COL-1、COL-3及α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞排列紊亂，纖維化明顯。與TAC組比較，DH組LVEF、LVFS、心肌組織miR-378上升，LVEDD、LVESD、血漿NT-pro BNP、TGF-β1、COL-1、COL-3及α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞排列趨于整齊，膠原纖維沉積減輕。結(jié)論 丹紅注射液能夠改善壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠心肌纖維化，其機(jī)制與調(diào)控miR-378/TGFβ-1信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 丹紅注射液；miR-378；心力衰竭；心肌纖維化；壓力超負(fù)荷；轉(zhuǎn)化生長因子β1

〔中圖分類號(hào)〕R256.2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.004

Mechanism of Danhong Injection on the myocardial fibrosis of heart failure

rats with stress overload based on miR-378

XIONG Xiajun1， HU Siyuan2， ZHONG Senjie2， ZHANG Qian2， FAN Xingyu2， HU Zhixi2*

1. Changsha Economic Development Zone Hospital， Changsha， Hunan 410019， China; 2. Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effect and mechanism of Danhong Injection（DHI） on myocardial fibrosis in heart failure rats with stress overload. Methods Fifty rats received transverse aortic constriction （TAC）， and after 9 weeks of modeling， they were randomly divided into model （TAC） group， Danhong Injection （DHI） group （6.0 mL·kg-1）， Captopril （8.8 mg·kg-1） group. And another 10 rats were set as the sham-operated group. After 15 days of intervention， echocardiogram detection was performed on rats in each group. Serum N-terminal pro brain natriuretic peptide （NT-pro BNP） content was determined by enzyme-linked immunoassay; myocardial pathology and fibrotic change was observed by HE and Masson staining; transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， collagen-1 （COL-1）， collagen-3 （COL-3） and α smooth muscle act （α-SMA） expression of myocardial tissue was detected by Western blot; the expression of miR-378， TGF-β1 mRNA， Col-1 mRNA， Col-3 mRNA， and α-SMA mRNA of myocardial tissue was detected by qRT-PCR. Results Compared with the sham-operated group， the left ventricular ejection fraction （LVEF）， the left ventricular fractional shortening rate （LVFS）， and miR-378 of myocardial tissue in the TAC group decreased; the left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD）， the left ventricular end systolic diameter （LVESD）， plasma NT-pro BNP， TGF-β1， COL-1， COL-3， α-SMA mRNA and protein expression were significantly higher （P<0.01）; disordered arrangement of the cells and obvious fibrosis was shown. Compared with TAC group， the expression of LVEF， LVFS and miR-378 of myocardial tissue increased， and the LVEDD， LVESD， plasma NT-pro BNP， TGF-β1， COL-1， COL-3， α-SMA mRNA and protein expression decreased significantly in DHI group （P<0.01）; cell arrangement tended to be neat， and the deposition of collagen fibers was reduced. Conclusion DHI can reduce myocardial fibrosis in heart failure rats with stress overload， and its mechanism is related to the expression regulation of miR-378/TGFβ-1 signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Danhong Injection; miR-378; heart failure; myocardial fibrosis; stress overload; transforming growth factor β1

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是指由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損所致的一組復(fù)雜臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為體循環(huán)淤血、肺循環(huán)淤血及各器官、組織灌注不足，是各種心血管疾病的終末階段[1]。CHF是全球性的心血管疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界心力衰竭患者近3770萬人，其中，我國心力衰竭患者約400萬人，預(yù)計(jì)到2030年全球心力衰竭患病率將增加25%，且相關(guān)的醫(yī)療支出預(yù)計(jì)將增加1倍以上[2-4]。目前，心力衰竭的治療取得一定進(jìn)展，但發(fā)病率和死亡率（5年死亡率約50%）仍然很高，成為全球公共衛(wèi)生的一大難題[5]。心臟重構(gòu)是心力衰竭的主要病理特征。心肌纖維化是心臟重構(gòu)重要的形態(tài)改變，兩者在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起主要作用，影響疾病的向愈和向逆。因此，抑制心肌纖維化是防治CHF的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

MicroRNA屬于短鏈非編碼RNA，常作為細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[6]。研究證實(shí)，MicroRNA在人類和鼠類的血流動(dòng)力學(xué)壓力過載中異常表達(dá)，是調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)和纖維化的關(guān)鍵成分[7-9]。MicroRNA-378（miR-378）在心臟組織中高表達(dá)，具有改善心肌缺血、抑制心肌肥厚、改善心肌纖維化等作用。心肌纖維化歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“胸痹”等范疇，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、久病入絡(luò)，本虛為陽氣虧虛，標(biāo)實(shí)為痰濁、瘀血。其中血瘀是心肌纖維化病變過程中的重要病機(jī)和病理產(chǎn)物。因此，活血化瘀法日益受到重視[10]。本課題組前期基于“以方測(cè)證”法證實(shí)主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction， TAC）心力衰竭大鼠為心血瘀阻證，活血化瘀代表藥物丹紅注射液能夠顯著改善TAC心力衰竭大鼠心肌纖維化[11]。因此，本研究從miR-378探討壓力超負(fù)荷心力衰竭心血瘀阻證心肌纖維化機(jī)制及丹紅注射液干預(yù)作用，為臨床防治心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，共60只，雄性，6周齡，體質(zhì)量（210±10） g，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。研究方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)LL2021011302。

1.2 ?主要儀器及藥物

SonoScape-S2N型超聲診斷儀（深圳開立科技公司），MB-530 型酶標(biāo)儀（深圳匯松科技發(fā)展公司），RWD407型呼吸機(jī)（深圳瑞沃德生命科技公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）。氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain

natriuretic peptide， NT-pro BNP）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：G28032936）。一抗轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-1， COL-1）、Ⅲ型膠原蛋白（collagen-3， COL-3）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， ɑ-SMA）、二抗HRP goat anti-mouse IgG均購自美國proteintech，貨號(hào)分別為21898-1-AP、67288-1-Ig、22734-1-AP、14395-1-AP、SA00001-1。丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司，規(guī)格20 mL/支，批號(hào)：20112012），卡托普利片（重慶科瑞制藥集團(tuán)有限公司，規(guī)格25 mg/片，批號(hào)：641003），注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥有限公司，規(guī)格0.48 g/瓶，批號(hào)：43200909）。

2 方法

2.1 ?模型制備

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠7 d后隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組10 只和造模組50只。TAC模型的制備參照文獻(xiàn)[11]，先稱取大鼠體質(zhì)量，采用10%水合氯醛以3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠四肢及頭部于恒溫臺(tái)，前胸部及頸部脫毛處理后消毒備皮。沿頸部正中線切開表皮再鈍性分離頸部結(jié)締組織及氣管兩側(cè)肌肉，暴露氣管后行氣管插管并機(jī)械通氣。于左側(cè)第2、第3肋間隙作橫向切口鈍性分離開胸，分離胸腺以充分暴露主動(dòng)脈胸段。采用4-0號(hào)手術(shù)線穿過左頸總動(dòng)脈與無名動(dòng)脈間，并提起主動(dòng)脈弓，縮窄墊針緊貼主動(dòng)脈弓進(jìn)行結(jié)扎，經(jīng)游標(biāo)卡尺測(cè)量，縮窄率為60%～65%，結(jié)扎完成后抽出墊針。逐層縫合肋間隙、肌肉及表皮，并用聚維酮碘消毒，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后予以脫機(jī)。Sham組主動(dòng)脈弓只穿線不結(jié)扎，余步驟與TAC制備保持一致。兩組術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素鈉20萬U。

2.2 ?心力衰竭模型評(píng)價(jià)方法

術(shù)后第9周，麻醉大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension， LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter， LVESD），眼眶取血檢測(cè)NT-pro BNP含量。與Sham組比，TAC組LVEF、LVFS顯著降低，LVEDD、LVESD顯著上升，血清NT-pro BNP顯著增高視為心力衰竭，模型復(fù)制成功。

2.3 ?分組與給藥

成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型（TAC）組、丹紅注射液（DH）組和卡托普利（Captopril）組。大鼠給藥時(shí)間均為15 d。給藥劑量[11]：（1）DH組腹腔注射，單次劑量 6.0 mL·kg-1，并按 4.0 mL·kg-1灌胃生理鹽水；（2）Captopril組：卡托普利片溶于生理鹽水中，按8.8 mg·kg-1劑量灌胃，并按 6.0 mL·kg-1腹腔注射滅菌注射用水；（3）Sham組、TAC組：按4.0 mL·kg-1灌胃生理鹽水，按6.0 mL·kg-1腹腔注射滅菌注射用水。

2.4 ?標(biāo)本采集與處理

藥物連續(xù)干預(yù)15天后，對(duì)大鼠再次行治療后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)及血清、心肌組織樣本采集。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉固定后，打開腹腔，用棉球小心分離腸道及黏膜組織，暴露腹主動(dòng)脈，行腹主動(dòng)脈取血，取血時(shí)針尖缺口朝下，每只取血約 5 mL，離心后（3 000 r·min-1，離心半徑 12 cm，時(shí)間15 min）每組選取6個(gè)樣本，每樣本取200 μL，后續(xù)采用ELISA法檢測(cè)NT-pro BNP含量。取血完畢開胸小心剪取完整心臟，輕輕擠掉心臟內(nèi)血液再經(jīng)PBS洗凈殘存血液，濾紙吸干后選取心尖部位剪取約200 mg左心室組織，裝入預(yù)先標(biāo)記編號(hào)好的凍存管，并立即放于液氮低溫保存，用于后續(xù)Western blot及qRT-PCR相關(guān)檢測(cè)，上述操作均于低溫冰塊上進(jìn)行；剩余組織用4%多聚甲醛溶液固定，后續(xù)用于HE染色和Masson染色，采用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

2.5 ?qRT-PCR法檢測(cè)心肌組織中miR-378、TGF-β1等相關(guān)指標(biāo)

取0.25 mg心肌組織，加入1 mL Trizol，充分研磨，混勻室裂解5 min，提取總RNA。以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系dNTP Mix 4 μL、Primer Mix 2 μL、RNA Template 7 μL、5×RT Buffer 4 μL、DTT 2 μL、HiFiScript 1 μL），42 ℃孵育15 min，85 ℃ 孵育 5 min 。其中miRNA反轉(zhuǎn)錄如下：根據(jù)所需用RNA的量，按ATP稀釋系數(shù)=5000/（RNA起始量），加1 mmoL Tris（pH 8.0）去稀釋10 mmoL ATP，加入反應(yīng)體系（總共RNA 3 μL、10×Poly（A） Polymerase Buffer1×2 μL、稀釋后的ATP 0.8 μL、E.coli Poly（A） Polymerase（5U/μL）0.4 μL、RNase-Free Water 11.8 μL，總量20 μL），37 ℃的條件下孵育15 min。

修飾后的miRNA cDNA第一鏈合成的過程：加入反應(yīng)體系[Poly（A）反應(yīng)液4 μL、超純dNTPs（10 mmoL each） 1 μL、25 μmoL RT primer 3 μL、5×RT Buffer 4 μL、SuperRT Reverse Transcriptase 0.5 μL、RNase-Free Water 7.5 μL]，在反應(yīng)體系中50 ℃及85 ℃條件下分別孵育50 min和5 min。各引物序列詳見表1。

以上述表格中所列基因序列實(shí)時(shí)定量PCR，按照預(yù)先配制好的擴(kuò)增液進(jìn)行定量擴(kuò)增。詳見表2。95 ℃中預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，重復(fù)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。收集每循環(huán)第3個(gè)步驟熒光信號(hào)量，反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，-ΔΔCt=對(duì)照組ΔCt-各樣品ΔCt，2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平，重復(fù)3次取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 ?Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

稱取約25 mg心肌組織置于200 bp RIPA裂解液反復(fù)研磨并置于冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑7 cm），吸取上清液分裝保存，參照BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育，用1×TBST將一抗按照一定比例稀釋，TGF-β1（1∶1000）、COL-1（1∶5000）、COL-3（1∶500）、α-SMA（1∶1000），GAPDH（1∶3000）。將封閉后的膜與一抗放于孵育盒，置于4 ℃冰箱放置12 h，再在室溫（25 ℃）靜置1 h，孵育結(jié)束后，回收一抗，然后將孵育盒置于搖床上用1×TBST洗滌15 min，重復(fù)3次。洗滌結(jié)束后，將預(yù)先稀釋好的二抗與膜置于搖床上室溫下孵育90 min。孵育結(jié)束后將孵育盒置于搖床用1×TBST 洗滌15 min，重復(fù)3次?，F(xiàn)配現(xiàn)用ECL化學(xué)發(fā)光液，將膜平鋪在顯影儀，吸取發(fā)光液均勻滴在膜上，反應(yīng)約1 min，然后將膜旁邊多余的發(fā)光液用濾紙吸干，關(guān)上顯影儀在暗盒內(nèi)顯色曝光約8 min。曝光完成后選取最佳圖片，數(shù)據(jù)分析采用Image J軟件。

2.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 25.0軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用“ｘ±s”表示，兩組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析法，事后多重比較采用LSD法；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?大鼠成活情況

大鼠主動(dòng)脈弓手術(shù)操作過程中共死亡12只，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)其死亡原因涉及主動(dòng)脈弓結(jié)扎過緊導(dǎo)致的急性左心衰、抽取縮窄針致主動(dòng)脈弓破裂、縱隔胸膜破裂致氣胸及肺部損傷等因素；后續(xù)成模階段共死亡老鼠9只，其死亡原因涉及呼吸障礙、心力衰竭。最終TAC組剩余29只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為TAC組10只，DH組10只，Captopril組9只；Sham組因開胸導(dǎo)致縱隔胸膜破裂死亡1只，剩余9只。

3.2 ?各組超聲心動(dòng)圖結(jié)果

造模9周后，與Sham組比較，TAC組LVEF和LVFS顯著下降（P<0.01），LVEDD和LVESD顯著升高（P<0.01）。藥物干預(yù)15天后，與Sham組比較，TAC組LVEF和LVFS顯著下降（P<0.01），LVEDD和LVESD顯著上升（P<0.01）；與TAC組比較，DH組和Captopril組LVEF和LVFS顯著上升（P<0.01），LVEDD和LVESD明顯下降（P<0.01）。詳見表 3。

3.3 ?各組血清NT-pro BNP結(jié)果

壓力超負(fù)荷造模9周后，與Sham組比較，TAC組NT-pro BNP顯著升高（P<0.01）。藥物干預(yù)15天后，與Sham組比較，TAC組NT-pro BNP顯著升高（P<0.01）；與TAC組比較，DH組、Captopril組NT-pro BNP顯著下降（P<0.01）。詳見表4。

3.4 ?HE染色結(jié)果

光鏡下觀察HE染色，Sham組細(xì)胞排列整齊、輪廓清晰，閏盤、橫紋清晰可見，細(xì)胞核大小形態(tài)正常；TAC組細(xì)胞排列明顯紊亂不齊，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫并伴細(xì)胞核消失及凝固性壞死；DH組及Captopril組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯細(xì)胞水腫及壞死。詳見圖1。

3.5 ?Masson染色結(jié)果

光鏡下觀察Masson染色，與Sham組比較，TAC組肌纖維排列紊亂，其間可見明顯膠原纖維沉積；與TAC組比較，DH組及Captopril組藍(lán)染膠原纖維明顯減少。詳見圖2。

3.6 ?各組大鼠干預(yù)后纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)量

各組干預(yù)15天后，與Sham組比較，TAC組心肌組織中TGF-β1、α-SMA、COL-1、COL-3蛋白均顯著升高（P<0.01）；與TAC組比較，DH組、Captopril組心肌組織中TGF-β1蛋白、α-SMA蛋白、COL-1蛋白、COL-3蛋白均顯著下降（P<0.01）。詳見表5，圖3。

3.7 ?各組大鼠干預(yù)后纖維化因子相對(duì)表達(dá)量

各組干預(yù)15天后，與Sham組比較，TAC組心肌組織中miR-378表達(dá)顯著下降（P<0.01），TGF-β1、α-SMA、COL-1、COL-3 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與TAC組比較，DH組、Captopril組心肌組織中miR-378表達(dá)顯著升高（P<0.01），TGF-β1、α-SMA、COL-1、COL-3 mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.01）。詳見表6。

4 討論

心力衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“心脹”“心痹”“心水”等范疇。心力衰竭病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為氣虛、氣陰兩虛、陽虛，標(biāo)實(shí)為痰飲、瘀血及水飲。正如《素問·水熱穴論》所言：“水病，下為胕腫大腹，上為喘呼不得臥者，標(biāo)本俱病。”后世醫(yī)家認(rèn)為“瘀血”為心力衰竭關(guān)鍵病機(jī)[12]，如清代醫(yī)家王清任、唐容川等認(rèn)為“血管無氣，必停而為瘀”，“血積既久，其水乃成”，“瘀血化水，亦發(fā)水腫”。現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為血瘀既是病機(jī)又是病理產(chǎn)物，貫穿心力衰竭發(fā)展始終。如《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》[13]及《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》[14]認(rèn)為血瘀是心力衰竭關(guān)鍵病機(jī)，心血瘀阻是其中心環(huán)節(jié)。中醫(yī)古籍中并無心肌纖維化相關(guān)記載，基于絡(luò)病學(xué)說心肌纖維化可歸屬“絡(luò)病”范疇[15]，正如《醫(yī)林改錯(cuò)》記載：“久病入絡(luò)為瘀?！别鲅切募±w維化關(guān)鍵病理機(jī)制，活血化瘀是其關(guān)鍵治則，現(xiàn)代研究同樣證實(shí)活血化瘀法能夠顯著改善心肌纖維化及心室重構(gòu)[16-17]。

TAC是在模擬主動(dòng)脈瓣狹窄基礎(chǔ)上，造成左室后負(fù)荷增加，持續(xù)的壓力負(fù)荷造成左室失代償及心肌纖維化，最早由ROCKMAN研制用來研究心室重構(gòu)[18]。本研究在造模第9周后對(duì)兩組大鼠眼眶取血，Elisa檢測(cè)大鼠血清NT-pro BNP值；并進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。結(jié)果表明：與Sham組比較，TAC組NT-pro BNP、LVESD、LVEDD值升高，LVEF、LVFS顯著降低。LVEF是評(píng)價(jià)心功能重要指標(biāo)。心力衰竭根據(jù)LVEF分為三類[19]：射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)中間值的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭。但臨床在診斷心力衰竭時(shí)，此項(xiàng)指標(biāo)存在一定主觀性，故往往需借助NT-pro BNP值對(duì)心力衰竭做出準(zhǔn)確判斷。NT-pro BNP由左心室心肌分泌，生物變異率低、代謝周期較長，在血漿中較為穩(wěn)定[20]，各大指南均將NT-pro BNP作為心力衰竭診斷的重要標(biāo)記物[21-22]。本研究結(jié)果提示TAC組LVEF、LVFS下降，LVESD、LVEDD增大，NT-pro BNP增高，說明主動(dòng)脈弓縮窄致心力衰竭模型復(fù)制成功，與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究基本一致[23]。

纖維化可影響各器官，纖維化正成為全球醫(yī)療負(fù)擔(dān)[24]。心肌纖維化是心室重構(gòu)重要因素，是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，抗纖維化治療是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。中醫(yī)藥治療纖維化療效顯著，在TAC大鼠心力衰竭模型中，丁超[25]、顧燕頻[26]、陳仁山[27]等證實(shí)活血法在治療心肌纖維化療效顯著。基于此，本研究采用丹紅注射液干預(yù)TAC大鼠心力衰竭模型。

miRNA在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，能夠調(diào)節(jié)適應(yīng)性和不適應(yīng)性心室重構(gòu)過程的基因表達(dá)水平[28]。miR-378是心肌纖維化調(diào)控因子之一，在壓力超負(fù)荷心力衰竭模型中，上調(diào)miR-378可以改善心室重構(gòu)及心功能[29]。LIU等[30]在TAC大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，miR-378通過抑制MAPK的磷酸化而減輕心肌纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，TAC組心肌纖維化更為明顯，心肌組織中miR-378顯著下調(diào)；與TAC組相比，DH組心肌纖維化改善明顯，心肌組織中miR-378顯著上調(diào)，miR-378可能是丹紅注射液治療心肌纖維化的可能機(jī)制及潛在靶點(diǎn)。

心肌纖維化根據(jù)病理特點(diǎn)分為修復(fù)性纖維化、間質(zhì)纖維化和血管周圍纖維化[31]。在壓力負(fù)荷心力衰竭中常發(fā)生間質(zhì)纖維化[32]。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度積累是纖維化主要病理表現(xiàn)，正常心臟組織中膠原蛋白生成、降解處于動(dòng)態(tài)平衡；壓力負(fù)荷等刺激可打破此平衡，造成膠原生成過度及比例失衡，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，心功能失代償。心臟ECM主要由Ⅰ型和Ⅲ型原纖維膠原組成。Ⅰ型和Ⅲ型原纖維膠原是構(gòu)成細(xì)胞外骨架的主要結(jié)構(gòu)蛋白。在正常心臟中，Ⅰ型膠原約占總心肌膠原的85%，負(fù)責(zé)構(gòu)建賦予其抗拉強(qiáng)度的厚纖維。Ⅲ型膠原蛋白占總膠原蛋白的11%，負(fù)責(zé)基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的彈性[33]。α-SMA是心臟成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物[34]，活化的肌成纖維細(xì)胞可大量分泌膠原蛋白促進(jìn)心肌纖維化。TGF-β1是心臟成纖維細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子，故抑制TGF-β1是改善心肌纖維化的關(guān)鍵所在。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Sham組相比，TAC組TGF-β1、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及α-SMA mRNA及蛋白均顯著增高；與TAC組相比，DH組TGF-β1、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及α-SMA mRNA及蛋白均顯著下調(diào)。從以上結(jié)果可知miR-378與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)，即TAC組miR-378顯著下調(diào)，TGF-β1明顯上調(diào)，DH組miR-378顯著上調(diào)，TGF-β1卻明顯下調(diào)，故推測(cè)丹紅注射液能夠上調(diào)心肌組織中miR-378水平，抑制TGF-β1表達(dá)，從而改善心肌纖維化。

綜上所述，本研究通過主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠模型，研究丹紅注射液對(duì)心力衰竭大鼠心肌纖維化的改善機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹紅注射液能夠下調(diào)心肌組織中膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及α-SMA蛋白，改善心肌纖維化，其作用機(jī)制可能與提高心肌組織中miR-378表達(dá)，下調(diào)TGF-β1有關(guān)。心臟成纖維細(xì)胞活化是心肌纖維化的主要機(jī)制，相關(guān)研究表明miR-378在心肌細(xì)胞中大量表達(dá)，在心臟成纖維細(xì)胞中不表達(dá)，丹紅注射液是否與提高心肌細(xì)胞中miR-378表達(dá)，后通過某種機(jī)制再調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞，從而改善纖維化，有待深入研究。

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〔收稿日期〕2023-03-04

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81774208，82274412）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019JJ50447）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)項(xiàng)目（2020B1111100001）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目青年課題（2021180）。

〔第一作者〕熊霞軍，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：心血管疾病證本質(zhì)與診治規(guī)律。

〔通信作者〕*胡志希，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：515800272@qq.com。