SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析24個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性

唐梅　孫富　何 聰　盧宏琮　黃 鸝　夏秀忠　唐忠平　鐘志堅　陸桂耀

關(guān)鍵詞：廣西；常規(guī)香稻；SSR 熒光標(biāo)記；毛細(xì)管電泳；遺傳多樣性

中圖分類號：S511 文獻標(biāo)識碼：A

隨著近年來消費者對稻米品質(zhì)要求的不斷提高，優(yōu)質(zhì)香稻品種以飯香濃郁和營養(yǎng)豐富等優(yōu)異品質(zhì)越來越受到市場的青睞。從1980 年我國開始進行香稻育種，目前已經(jīng)育成一批優(yōu)質(zhì)香稻品種[1]。廣西在2000 年以來也相繼育成了‘八桂香[2]、‘田東香[3]、‘玉香占[4]、‘三香628[5]等香稻品種。但由于廣西自育香稻品種的優(yōu)質(zhì)米達標(biāo)率低、產(chǎn)量低和抗病性差等原因，推廣的香稻品種數(shù)量和質(zhì)量滿足不了市場需求[6]。為了滿足當(dāng)前消費者對稻米品質(zhì)好聞、好吃、好看、高營養(yǎng)的理想追求，因此廣西加快了優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻新品種的審定。而在香稻育種中，有香味基因的親本來源較少，且遺傳背景較近，從而使得香稻品種的遺傳多樣性較低[1]。通過對香稻品種的遺傳多樣性進行分析，理清香稻品種的親緣關(guān)系，加強香稻品種的遺傳特性研究，可為選育廣西優(yōu)質(zhì)香稻品種提供技術(shù)參考。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)分析水稻品種遺傳多樣性是目前應(yīng)用最廣泛的手段之一，其中簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、操作方便，可利用SSR 標(biāo)記對香稻進行遺傳多樣性分析[7-13]。唐傲等[9]利用60 個SSR 標(biāo)記對國內(nèi)外370 份香稻材料的遺傳多樣性進行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參試材料可分為秈粳兩大類。朱勇良等[10]利用40 對SSR 引物對太湖稻區(qū)和國內(nèi)其他地區(qū)的39 個香稻品種進行遺傳多樣性分析，試驗結(jié)果基本反映了不同品種間的親緣關(guān)系。趙鳳民等[13]用50 對SSR 分子標(biāo)記對42 份黑龍江省香稻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究，結(jié)果說明香稻資源的區(qū)域特征明顯，各類群中的香稻資源親緣關(guān)系較近。

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法步驟繁多，耗時耗力且靈敏度低。而SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)可直接讀取目的片段準(zhǔn)確大小，大大降低了分辨擴增產(chǎn)物的難度，提高了研究的效率和準(zhǔn)確性。利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)用于香稻特別是涉及廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性的研究還未見報道。本研究采用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，利用48 對SSR 分子標(biāo)記對廣西審定的24 個常規(guī)香稻品種進行遺傳多樣性分析，以期分析廣西常規(guī)香稻品種間的遺傳多樣性，闡明廣西常規(guī)香稻的遺傳多樣性特點，為廣西常規(guī)香稻品種的遺傳基礎(chǔ)拓展、品種選育和鑒定提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以通過廣西審定的24 個常規(guī)香稻品種為材料（表1）。種子由廣西壯族自治區(qū)種子管理站提供。

1.2 方法

1.2.1 廣西常規(guī)香稻品種DNA 的提取 將香稻種子發(fā)芽7 d 后，剪取新鮮葉片，采用CTAB 法提取幼苗葉片中的DNA。

1.2.2 SSR 熒光引物及PCR 反應(yīng) 48 對SSR 核心標(biāo)記引物由農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1433—2014）推薦，熒光引物由上海生工生物公司合成。12 μL的SSR 反應(yīng)體系包括2×PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL 。PCR 反應(yīng)在T100 PCR 儀（BIO-RAD， USA）上進行，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。

1.2.3 產(chǎn)物分析 取PCR 產(chǎn)物0.3 μL、分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，迅速冷卻到4 ℃后離心，在ABI3730XL DNA 遺傳分析儀上進行毛細(xì)管電泳，并用Data Collection 軟件收集電泳原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Genemapper 軟件分析原始數(shù)據(jù)，計算擴增片段大小。按照毛細(xì)管電泳遷移位置，用1 和0 分別代表檢測到擴增片段的有無，建立原始數(shù)據(jù)表。利用POPGENE 1.32 軟件統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)（Na）、Shannons 信息指數(shù)（I）、有效等位基因數(shù)（Ne），利用NTSYS 2.10e 軟件對各品種進行遺傳相似性分析，采用UPGMA（unweighted pairgroup method? with average）法對各品種進行聚類分析，利用PIC-CAL 計算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 48 對SSR 標(biāo)記的多態(tài)性分析

本研究利用覆蓋水稻12 條染色體的48 對SSR 引物對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannons指數(shù)（I）和多態(tài)信息含量值（PIC）檢測（表2）。結(jié)果表明，48 個SSR 位點在24 個廣西常規(guī)香稻品種中檢測到170 個等位基因，等位基因數(shù)（Na）的變化幅度為1～9 個，平均為3.54 個，說明這些引物可適于24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性檢測。有效等位基因數(shù)（Ne）的變化幅度為1～4.5534，平均為2.0736，其中有效等位基因數(shù)最高是RM21，其指數(shù)為4.5534，其次是RM481、RM493 和RM258，其指數(shù)分別為4.5000、4.4825和4.1739。說明這4 對引物有較高的檢測效率。Shannons 指數(shù)（I）的變化幅度為0～1.7942，平均為0.7726。多態(tài)信息含量（PIC）大于0.50 的位點為高度多態(tài)位點，在0.25～0.50 為中度多態(tài)位點，小于0.25 時為低度多態(tài)位點[14]。24 個廣西常規(guī)香稻品種的PIC 值的變化范圍為0～0.7541，平均為0.3732，屬于中度多態(tài)位點，說明24 個廣西常規(guī)香稻品種具有一定的遺傳變異。

2.2 遺傳相似性分析

使用NTSYS 2.10 軟件計算24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù)（表3），由表3 可知，24 個品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299～0.9600 之間，平均值為0.5790，其中‘三香628（11）與‘農(nóng)香32（19）遺傳相似系數(shù)最小，為0.3299，說明這2 個品種遺傳基礎(chǔ)差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；‘萬香696（14）與‘廣糧香2 號（15）、‘萬香696（14）與‘糧發(fā)香絲（16）、‘廣糧香2號（15）與‘糧發(fā)香絲（16）之間的遺傳相似性系數(shù)大， 其數(shù)值分別為0.9600 、0.9293 和0.9216，說明這幾個品種遺傳基礎(chǔ)差異較小，親緣關(guān)系接近。

2.3 聚類分析

在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行聚類分析（圖1），在遺傳相似性系數(shù)0.504 處分為三大群類。第Ⅰ大類包括‘八桂香（1）和‘農(nóng)香32（19）2 個品種，說明這2 個品種遺傳背景較為接近；第Ⅲ大類包括‘早香一號（2）、‘玉香占（4）和‘家福香1 號（10）3 個品種，說明這3 個品種具有相近的遺傳背景，與其他品種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；其余19 個品種被分到第Ⅱ大類。進一步遺傳分析表明，第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4個亞類，第ⅰ亞類只有‘桂香2 號（3）1 個品種；第ⅲ亞類有‘三香628（11）、‘桂香99（21）和‘桂香18（23）3 個品種；第ⅳ亞類只有‘柳豐香占（9）1 個品種；剩余14 個品種劃分到第ⅱ亞類。本研究基本反映了24 個常規(guī)香稻品種的親緣關(guān)系。

2.4 SSR 指紋圖譜的構(gòu)建

從48 對標(biāo)記中篩選出14 對等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、Shannons 指數(shù)和PIC 值較高的標(biāo)記，根據(jù)檢測到的引物等位基因差異，建立24 個廣西常規(guī)香稻品種的指紋圖譜。對14 個標(biāo)記的擴增片段按分子量大小排列，并進行數(shù)字編碼（表4）。按表4 順序?qū)?4 對標(biāo)記對應(yīng)的編碼組合，每個品種可得到唯一的數(shù)字編碼，組成每個品種的DNA 指紋圖譜（表5）。如‘三香628（11）的SSR 指紋編碼如下，毛細(xì)管電泳檢測到14 個標(biāo)記在‘三香628（11）中的擴增片段大?。╞p）為192/192、148/148、169/169、194/194、170/170、179/179、162/162、147/147、136/136、263/263、148/148、186/186、106/106、164/164，轉(zhuǎn)換成28位的指紋數(shù)字代碼為1122 5511 2244 4411 33663333 3311，其中第1、第2 位的“1、1”表示標(biāo)記RM583 在‘三香628（11）中的擴增片段（192/192）在其多態(tài)性片段中2 個片段排第1 位，第3、第4 位的“2、2”表示標(biāo)記RM71 的2 個擴增片段（148/148）在其多態(tài)性片段中2 個片段排第2 位（表4），其余24 位類推。

3 討論

廣西香稻的種植歷史比較悠久[6]，早在南宋時靖西香糯就被列為朝廷貢品，目前仍是馳名中外的優(yōu)良品種。但是由于近年來廣西市場上可用的香稻品種不多，無法滿足消費者對香稻的需求。因此加快廣西香稻品種的選育和推廣對廣西香稻產(chǎn)業(yè)有著十分重要的意義。而研究廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性，分析香稻品種之間的親緣關(guān)系，挖掘和利用香稻的優(yōu)異基因，可為廣西優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻品種選育提供技術(shù)參考。

已有的水稻品種遺傳多樣性研究中，SSR 擴增產(chǎn)物主要由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[15-17]，較難準(zhǔn)確讀出擴增片段大小，并且整合不同試驗批次和不同膠板的數(shù)據(jù)是個難題，容易出現(xiàn)人為的誤讀或錯讀。SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測可直接讀出擴增的目標(biāo)片段大小，檢測數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確[18-20]，便于遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)整合及分析。

本研究利用國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1433—2014）推薦的48 對SSR 引物，應(yīng)用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行遺傳多樣性，可準(zhǔn)確有效地分析24 個廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性。結(jié)果表明，在48 個SSR 位點上檢測到等位基因數(shù)170 個，等位基因數(shù)變化幅度為1～9 個，平均為3.54 個；比云南地方香稻品種[21]檢測到的平均等位基因5.44 個和黑龍江香稻[13]檢測到的平均等位基因4.08 個低。PIC 值的變化范圍為0～0.7541，平均值為0.3732，比云南地方香稻[21]的0.4300 和黑龍江香稻[13]的0.4649 低。說明廣西審定的常規(guī)香稻品種的遺傳背景比較接近，其遺傳多樣性不夠豐富。這與陳遠(yuǎn)孟等[22]的研究結(jié)果相似。

本研究利用NTSYS 2.10 軟件計算24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果顯示24 個品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299～0.9600 之間，平均為0.5790，低于太湖地區(qū)香稻品種的0.6400[10]，但高于云南地區(qū)香稻的0.4700[21]，進一步說明廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性，但不夠豐富。在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對24份廣西常規(guī)香稻品種進行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在遺傳相似性系數(shù)0.504 處24 個品種可分為三大群類，第Ⅰ大類包括2 個品種，第Ⅱ大類包括19 個品種，第Ⅲ大類包括3 個品種。而第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4 個亞類。聚類分析結(jié)果表明，雖然三大類群間部分品種存在一定遺傳差異，但遺傳多樣性還不夠豐富，其原因可能是廣西香稻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較窄，且育種單位的親本材料遺傳背景相近[22]。因此在育種的親本選擇上可引入國內(nèi)外地緣關(guān)系較遠(yuǎn)和遺傳背景差異較大的香稻種質(zhì)資源。

DNA 指紋圖譜具有特異性，比表型鑒定更能準(zhǔn)確地鑒定品種（系），可為品種選育和鑒定提供參考[23]。本研究利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳對24 個廣西香稻品種進行SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測，從48 對SSR 引物中篩選出14 對多態(tài)性較好的SSR 構(gòu)建了24 個廣西常規(guī)香稻品種的DNA 指紋圖譜?？赏耆珜?4 個廣西常規(guī)香稻品種區(qū)別開來，適于24 個廣西常規(guī)香稻品種的品種鑒定。本研究建立的24 個廣西常規(guī)香稻品種DNA指紋圖譜，可大幅提高24 個香稻品種鑒定的準(zhǔn)確度，對廣西香稻品種的鑒定和保護具有現(xiàn)實意義。

雖然廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性，但由于其親本來源較單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此要培育更好的香稻品種或進行品種改良，應(yīng)多引進國內(nèi)外豐富的香稻資源，挖掘更多的優(yōu)異基因?qū)氲綇V西香稻品種中，以拓寬廣西香稻品種的遺傳基礎(chǔ)，從而培育更好更優(yōu)異的知名香稻品種，打響廣西香米品牌。本研究結(jié)果可為廣西香稻品種的育種親本選配和開發(fā)新的遺傳資源提供參考。