廣西喀斯特地區(qū)毛唇芋蘭根內(nèi)與根際土壤真菌群落組成分析

譚小明 楊鑫鳳 孫雪萍 周雅琴 胡世一 袁長格 石忠衡

?摘 要：? 為探索蘭科（Orchidaceae）植物毛唇芋蘭（Nervilia fordii）根內(nèi)和根際土壤真菌群落多樣性，該研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，分析了大新（DX）和龍州（LZ）兩個樣地（簡稱兩地）毛唇芋蘭根內(nèi)和根際土壤的真菌組成。結(jié)果表明：（1）兩地的毛唇芋蘭根內(nèi)和根際土壤真菌多樣性很豐富，根際土壤真菌多樣性均高于根內(nèi)，主根的真菌多樣性高于走莖。（2）通過測序共獲得有效序列118 040條，207個可操作分類單元（OTUs）涉及8門19綱42目86科123屬。（3）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）真菌是兩地毛唇芋蘭根內(nèi)真菌的共同優(yōu)勢菌群，涉及膠膜菌科（Tulasnellaceae）、Trimorphomycetaceae、角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）、馬拉色菌科（Malasseziaceae）和小皮傘科（Marasmiaceae）等，其中優(yōu)勢科和優(yōu)勢屬分別是膠膜菌科（75%）和瘤菌根菌屬（Epulorhiza）（56%），而土壤中的優(yōu)勢菌屬則是鐮刀菌屬（Fusarium）。綜上認(rèn)為，毛唇芋蘭根內(nèi)與根際土壤中的優(yōu)勢菌群既差異顯著也存在一些共同的OTUs，同時該研究結(jié)果暗示Epulorhiza真菌可能對毛唇芋蘭種子萌發(fā)和種苗生長發(fā)育產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。

關(guān)鍵詞： 毛唇芋蘭， 菌根真菌， 高通量測序， 真菌多樣性， FUNGuild

中圖分類號：? Q948.15

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）03-0405-10

Analysis of fungal communities in roots and root-associated

soil of Nervilia fordii from karst areas of Guangxi

TAN Xiaoming1， YANG Xinfeng1， SUN Xueping1， ZHOU Yaqin1，2*，

HU Shiyi1， YUAN Changge1， SHI Zhongheng1

（ 1. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， 530200， China; 2. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant， Nanning， 530023， China ）

Abstract：? To explore the fungal community diversity? in the roots of Nervilia fordii as well as in the root-associated soil， we collected the terrestrial orchids grown in Daxin （DX） County and Longzhou （LZ） County of the karst areas in Guangxi Zhuang Autonomous Region， China as well as the root-associated soil， respectively. We analyzed the composition of fungal communities in the roots and the root-associated soil by taking the Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology. The results were as follows： （1）The fungal diversity in the roots and root-associated soil of DX and LZ were very rich. In addition， the diversity of fungi in root-associated soil was higher than that in roots， and the fungal diversity in the taproot was higher than that in walking stem. （2） A total of 118 040 valid sequences and 207 operational taxonomic unites （OTUs） were obtained. The BLAST results showed that these OUTs involved 8 phyla， 19 classes， 42 orders， 86 families and 123 genera. （3） The dominant fungal communities in roots of two areas （DX and LZ） both were Basidiomycota including Tulasnellaceae， Trimorphomycetaceae， Ceratobasidiaceae and Malasseziaceae as well as Marasmiaceae. Among them， Tulasnellaceae （75%） and Epulorhiza （Sexual type： Tulasnella） （56%） were the dominant family and genus， respectively. However， Fusarium was the dominant fungal genus in the root-associated soil. In conclusion， there is a significant difference in fungal communities between roots and root-associated soil， but there is some common OTUs. More importantly， our results also suggest that these fungi species belonging to Epulorhiza may play an important effect on the seed germination and seedling growth of Nervilia fordii grown in the karst area of Guangxi.

Key words： Nervilia fordii， mycorrhizal fungi， high-throughput sequencing， fungal diversity， FUNGuild

毛唇芋蘭（Nervilia fordii）為蘭科（Orchidaceae）狹域分布植物，又名青天葵、獨腳蓮、珍珠葉等，主要分布于我國廣西、廣東、福建等地（梁永樞等，2017）。其干燥葉或全株具有清熱、潤肺止咳、解毒散瘀等功效，其中對小兒咳嗽的治療效果尤其明顯，同時也是備受港臺地區(qū)民眾喜歡的一種高級菜，因而廣受關(guān)注（梅全喜，2008；邱莉等，2011；Huang et al.，2012）。然而，由于棲息地受到果農(nóng)開墾的嚴(yán)重破壞，加之種子自然條件下萌發(fā)率低，致使毛唇芋蘭野生資源瀕臨枯竭，因此極大地限制了野生毛唇芋蘭種群的擴(kuò)展和生存。有研究表明，適宜的菌根真菌對蘭科植物種子萌發(fā)和種苗生長發(fā)育產(chǎn)生重要的影響（Rasmussen & Rasmussen，2009；Fay，2016；陳艷紅等，2017）。蘭科植物根際土壤中的真菌可以通過根系進(jìn)入蘭科植物根細(xì)胞中定殖，進(jìn)而與宿主植物形成共生關(guān)系（McCormick et al.，2016；Waud et al.，2016）。然而，目前對于根際土壤真菌的組成與蘭科植物毛唇芋蘭根內(nèi)菌根真菌的相關(guān)性仍然不明確。因此，研究毛唇芋蘭根中和根際土壤中真菌的組成和相關(guān)性，對于篩選和利用有效菌根真菌實現(xiàn)毛唇芋蘭野生種群恢復(fù)和資源可持續(xù)利用具有重要意義。

McCormick等（2016）研究表明，地生型蘭科植物種子萌發(fā)的棲息地更容易發(fā)現(xiàn)特異性共生真菌，其豐度與成年蘭科植物的距離呈一定的正相關(guān)；有的蘭科植物根內(nèi)真菌在土壤中普遍存在，這種特異性真菌更有助于蘭科植物的生長（Waud et al.，2012）。蘭科植物根內(nèi)真菌群落和根際土壤中的真菌群落差異顯著，并且這兩種真菌群落在一定程度上是相互獨立的，菌根真菌的種類和豐度與根際土壤中菌根真菌的種類與豐度無明顯聯(lián)系（蔣玉玲等，2019）。除了擔(dān)子菌類菌根真菌以外，鐮刀菌屬（Fusarium）真菌還是地生蘭根中和根際土壤中的特異性優(yōu)勢菌群（王曉國等，2021）。基于上述蘭科植物菌根的研究現(xiàn)狀，本文首次以我國廣西喀斯特地區(qū)龍州和大新兩個點為研究區(qū)域，以分布于該地區(qū)的野生毛唇芋蘭為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)方法，通過分析該區(qū)域內(nèi)兩個樣地毛唇芋蘭根系共生真菌和根際土壤真菌的組成及差異，擬探討以下問題：（1）喀斯特地區(qū)毛唇芋蘭根部內(nèi)生真菌及其根際土壤真菌在分子水平上區(qū)系組成以及優(yōu)勢內(nèi)生真菌類群；（2）兩地毛唇芋蘭根系共生真菌組成存在差異及其形成原因。本研究結(jié)果對于今后系統(tǒng)研究廣西喀斯特地區(qū)毛唇芋蘭菌根真菌資源，以及采用菌根技術(shù)實現(xiàn)毛唇芋蘭種子伴菌萌發(fā)及地生型蘭科藥用植物的資源保護(hù)具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

毛唇芋蘭植株與土壤樣本于2020年10月7日從廣西壯族自治區(qū)崇左市龍州縣（106°67′ E、22°52′ N，海拔333 m）和大新縣（107°05′ E、22°81′ N，海拔311 m）采集。選取毛唇芋蘭健康植株，整株挖出并帶根際土放入自封袋中，12 h內(nèi)將樣品帶回廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)的實驗室，隨即在流水下沖洗干凈根表雜質(zhì)，使用濾紙吸干根表水分后，迅速采用液氮急凍，之后置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

根際土壤采自毛唇芋蘭根系表面0～1 cm范圍內(nèi)的土層，將采集的土壤置于無菌離心管中，編號分別為DXTR（大新土壤）和LZTR（龍州土壤）；分別取大新毛唇芋蘭和龍州毛唇芋蘭的主根、走莖（各3個重復(fù)）置于無菌離心管中，編號為DXZG（-1，-2，-3）、DXZJ（-1，-2，-3）、LZZG（-1，-2，-3）、LZZJ（-1，-2，-3）。

1.2 樣品基因組DNA的提取和分析

樣品經(jīng)冷鏈送至廣州基迪奧生物科技有限公司，進(jìn)行DNA的提取和ITS rDNA的測序分析；采用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增ITS的ITS1 plant區(qū)（引物序列分別為ITS1 F KYO2：5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′和ITS86R：5′-TTCAAAGATTCGATGATTCAC-3′）；將純化后的PCR產(chǎn)物（即擴(kuò)增子）連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，上機進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序，并進(jìn)行相應(yīng)的信息分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

過濾低質(zhì)量Reads，將雙端Reads拼接為Tag，對Tag進(jìn)行低質(zhì)量過濾，得到的數(shù)據(jù)稱為Clean Tag；使用Usearch軟件進(jìn)行聚類（Schloss et al.， 2009），去除聚類過程中檢測到的嵌合體Tag，按照97%相似性進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，獲得OTU后，基于Effective Tag進(jìn)行OTU豐度統(tǒng)計。利用R語言vegan包進(jìn)行維恩圖分析（Oktalira et al.， 2019）和使用Qiime軟件（Schloss et al.， 2009）進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)，包括物種數(shù)（Sobs）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon指數(shù)）、辛普森指數(shù)（Simpson指數(shù)）、豐富度指數(shù)（Chao 1指數(shù)）、基于豐度的覆蓋估計值（Ace指數(shù)）、譜系多樣性指數(shù)（Pd指數(shù)）及覆蓋率（Goods coverage）分析；同時，采用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行差異特征發(fā)現(xiàn)和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果分析

通過對大新縣和龍州縣的野生毛唇芋蘭主根和走莖及根際土壤共14個樣品的真菌 rDNA基因ITS1區(qū)域進(jìn)行高通量測序。測序結(jié)果表明，質(zhì)控后每個樣品的測序標(biāo)簽數(shù)均超過110 000條（表1）；以測序數(shù)據(jù)量對應(yīng)OTU數(shù)量構(gòu)建的稀釋曲線趨向平坦（圖1），說明測序數(shù)據(jù)量能夠覆蓋樣品中絕大多數(shù)真菌種類，測序數(shù)據(jù)量合理。每個樣品的覆蓋率均達(dá)到0.999（表1），說明樣本中有序列沒有被測出的概率極低，測序深度合格。

Chao 1指數(shù)和Ace指數(shù)用于評定樣品中群落的豐富度；香農(nóng)指數(shù)則可反映出群落分布多樣性，其受到樣品群落中物種豐富度以及物種均勻度的影響（龐美霞等，2021）。大新主根（DXZG）Chao 1指數(shù)、Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別為302.67±7.23、316.04±3.41、1.10±0.23（圖2 ：A），龍州主根（LZZG）Chao 1指數(shù)、Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別為212.72±143.99、215.14±145.47、2.23±0.15。龍州主根群體中反應(yīng)群落多樣性變化的香農(nóng)指數(shù)（P=0.003 5）顯著性上升（圖2：A），而表征物種豐度的Chao 1指數(shù)（P>0.05）和Ace指數(shù)（P>0.05）相較于大新主根群體均有所下降但無明顯差異。大新走莖（DXZJ）Chao 1指數(shù)、Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別為205.41±113.57、210.70±118.47、0.72±0.25（圖2：B），龍州走莖（LZZJ）Chao 1指數(shù)、Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別為209.37±47.62、212.68±73.34、0.69±0.11（圖2：B）。由此可見，龍州走莖的真菌物種豐度及多樣性低于大新走莖組，但差異不顯著（P>0.05）。

2.2 根系共生真菌多樣性及相關(guān)性分析

從毛唇芋蘭2個根際土壤（DXTR、LZTR）樣品、6個走莖（DXZJ、LZZJ）樣品和6個主根（DXZG、LZZG）樣品內(nèi)檢測到大量OTU。首先，不同土壤樣品分析結(jié)果表明，DXTR共獲得411個OTU，多于LZTR中的OTU數(shù)量406；DXTR的真菌香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao 1指數(shù)以及Pd指數(shù)均略高于LZTR（表 1），說明大新毛唇芋蘭根際土壤真菌群落在豐富度和多樣性上均高于龍州毛唇芋蘭。另外，OTUs-Venn圖能夠直觀反映樣本間相同及其獨特的OTU。DXTR與LZTR真菌OTUs-Venn圖如圖3所示，2個土壤樣本中共獲得705個OTU，它們之間共有的OTU為112 個，DXTR特有OTU為299個，LZTR特有OTU為294個。因此，綜合Alpha多樣性指數(shù)及OTUs-Venn圖發(fā)現(xiàn)，大新和龍州的毛唇芋蘭根際土壤真菌的組成均較為豐富，但它們在真菌的組成、結(jié)構(gòu)和相對豐度上存在一定的差異。

DXZJ與DXZG、LZZJ與LZZG真菌OTUs-Venn圖（圖4）顯示，龍州毛唇芋蘭根系樣品共獲得221個OTU，其中走莖和主根共有126個OTU，主根特有OTU為59個，走莖特有OTU為36個；大新毛唇芋蘭根系樣品共獲得289個OTU，其中走莖和主根共有OTU為113個，主根特有OTU為109個，走莖特有OTU為67個。綜合Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，大新毛唇芋蘭與龍州毛唇芋蘭在青天葵根系共生真菌組成中均較為豐富，但在主根組的真菌部位組成、結(jié)構(gòu)及相對豐度上均比走莖組更高。

2.3 根系及其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成

從毛唇芋蘭的根系及其根際土壤中獲得有效序列118 040條，可操作分類單元207個，分屬于8門19綱42目86科123屬。以豐度均值排名Top10的物種作為主要分析對象，其他已知物種歸為others，未知物種標(biāo)記為unclassified；基于門、綱、目、科、屬、種分類水平，分析不同樣品組中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。由圖2可知，在不同的分類水平上，廣西喀斯特地區(qū)兩個不同產(chǎn)地之間供試樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

從門一級分類水平上分析，毛唇芋蘭根系與其根際土壤14個樣本中共檢測到的真菌涉及8個門（圖5：A），分別為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、梳霉門（Kickxellomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、蟲囊霉門（Entomophthoromycota），未鑒定出來的序

列（unclassified）占比為18.24%。毛唇芋蘭根系內(nèi)生真菌主要分布于擔(dān)子菌門（占76%），在DXZG、LZZG、DXZJ、LZZJ中占比分別為66.89%、78.68%、97.03%、96.39%；其次分布于子囊菌門（占10%），占比分別為1.90%、14.58%、0.74%和2.52%。子囊菌門在DXZJ與DXZG、LZZJ間的物種豐度均值均存在顯著差異（P=0.02，0.02）；LZZG與DXZG物種豐度均值存在顯著差異的真菌門為被孢霉門（P=0.01）；LZZJ與LZZG物種豐度均值存在顯著差異的真菌門為擔(dān)子菌門（P=0.02）。大新和龍州的根際土壤中優(yōu)勢菌門組成與含量存在顯著差異，前者的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（59.34%），后者的優(yōu)勢菌門為擔(dān)子菌門（36.63%）。

從綱一級分類水平上分析，毛唇芋蘭根系及其根際土壤中優(yōu)勢真菌群落主要包括傘菌綱（Agaricomycetes）（總占比58%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）（總占比5%）、銀耳綱（Tremellomycetes）（總占比3%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）（總占比1%）、古菌根菌綱（Archaeorhizomycetes）、馬拉色菌綱（Malasseziomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）、酵母綱（Saccharomycetes）（圖5：B）。unclassified序列占比為34.90%，others序列占比為0.35%。傘菌綱、糞殼菌綱、銀耳綱、散囊菌綱和古菌根菌綱在DXTR中的占比分別為6.74%、29.85%、0.07%、6.57%和12.79%，在DXZG中的占比分別為38.85%、1.11%、1.38%、0.25%和0.18%，在DXZJ中的占比分別為60.43%、0.25%、1.04%、0.14%和0.05%；在LZTR中的占比分別為28.52%、6.12%、0.67%、0.59%和0.002%，在LZZG中的占比分別為66.24%、9.66%、9.66%、1.77%和0.001%，在LZZJ中的占比分別為93.20%、0.51%、0.32%、0.87%和0.0003%。各真菌綱在不同產(chǎn)地毛唇芋蘭根際土壤中所占比例存在顯著差異（P<0.05）。在根系樣品之間真菌組成及比例存在差異，其中LZZJ與LZZG物種豐度均值均存在顯著差異的真菌綱為傘菌綱（P=0.03），DXZG與LZZG物種豐度均值均存在顯著差異的真菌綱為古菌根菌綱（P=0.01）和馬拉色菌綱（P=0.01）。

從目一級分類水平上分析（圖5：C），主要包括雞油菌目（Cantharellales）（占比57%）、銀耳目（Tremellales）（占比3%）、肉座菌目（Hypocreales）（占比2%）、散囊菌目（Eurotiales）（占比1%）、古菌根菌目（Archaeorhizomycetales）、馬拉色菌目（Malasseziales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、傘菌目（Agaricales）、煤炱目（Capnodiales）。

從科一級分類水平上分析（圖5：D），膠膜菌科（Tulasnellaceae）占擔(dān)子菌的75%，此外，還有少數(shù)屬于Trimorphomycetaceae、角擔(dān)菌科（Ceratobasi-diaceae）、馬拉色菌科（Malasseziaceae）、小皮傘科（Marasmiaceae）等；子囊菌主要包含叢赤殼科（Nectriaceae）、古菌根菌科（Archaeorhizomycetaceae）、曲霉科（Aspergillaceae）、毛殼科（Chaetomiaceae）、小叢殼科（Glomerellaceae）等。

從屬一級分類水平上分析（圖5：E），主要包括瘤菌根菌屬（Epulorhiza）、原隱球菌屬（Saitozyma）、鐮刀菌屬（Fusarium）、古菌根菌屬（Archaeorhizomyces）、馬拉色菌屬（Malassezia）、曲霉屬（Aspergillus）、翼孢菌屬（Tetrapyrgos）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、青霉屬（Penicillium）。根際土中顯著優(yōu)勢真菌菌種為鐮刀屬（Fusarium）。毛唇芋蘭根莖的優(yōu)勢菌群均為瘤菌根菌屬（Epulorhiza）真菌，在所分離真菌中占比高達(dá)56%，并且在根際土壤中該屬真菌含量也很高，在大新土壤和龍州土壤中的占比分別為4%和14%。

從種一級分類水平上分析（圖5：F），主要包含貝殼狀革菌（Panus conchatus）、稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、大孢圓孢霉（Staphylotrichum coccosporum）、Septoria cretae、馬氏梭菌（Sodiomyces magadii）、Humicola olivacea、Tetrapyrgos subcinerea、Malassezia restricta、莢膜梭菌（Saitozyma podzolica）等。

總之，不同分類層級的真菌群落在兩地根際土壤中，它們在真菌的組成、結(jié)構(gòu)及相對豐度上存在一定的差異，并且兩地不同根系之間也存在一定差異，主根在真菌的組成、結(jié)構(gòu)及相對豐度上均比走莖更高。

3 討論與結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)，比較分析了廣西喀斯特地區(qū)的地生型蘭科植物毛唇芋蘭根系及其根際土壤中真菌菌落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤菌根菌屬（有性型為膠膜菌屬）真菌是大新與龍州兩個樣地的毛唇芋蘭根中絕對優(yōu)勢菌群。Jacquemyn等（2011）研究認(rèn)為，地生蘭的種子成熟后落入土壤中經(jīng)歷長時間的發(fā)育，在此期間依賴共生真菌提供穩(wěn)定、持久的C源。因此，各地的地生蘭往往與菌根真菌形成高特異性的菌根關(guān)系，表現(xiàn)為大多數(shù)地生蘭均與膠膜菌屬菌群共生，如竹葉蘭屬（Arundina）植物（Meng et al.，2019）、杓蘭屬（Cypripedium）植物（Yuan et al.，2010）等地生蘭的優(yōu)勢共生菌群主要是膠膜菌屬菌群。更為重要的是，膠膜菌不僅是蘭科植物菌根真菌區(qū)系組成中的絕對優(yōu)勢類群，還是一類重要的蘭科植物共生萌發(fā)真菌（Rafter et al.，2016；陳娟等，2017）。因此，瘤菌根菌屬菌群可能在毛唇芋蘭種子萌發(fā)和球莖生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用，但更多證據(jù)還有待真菌共生萌發(fā)實驗進(jìn)一步確證。此外，瘤菌根菌屬真菌在兩地主根中的豐度均比走莖高，這可能與主根生長周期長、走莖生長周期短且側(cè)重于生殖生長的特點有關(guān)。

真菌群落的組成和豐度對植物生態(tài)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)具有重要作用，其中核心真菌組和關(guān)鍵物種的貢獻(xiàn)一直是真菌生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點（熊丹等，2020）。本研究基于FUNGuild數(shù)據(jù)庫，對大新和龍州兩地的毛唇芋蘭根系和根際土壤中真菌的主要OTU進(jìn)行了功能預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共生型（Symbiotroph）是兩地毛唇芋蘭主根和走莖中真菌群落最主要的營養(yǎng)類型，相對豐度分別為63%和92%（龍州）、36%和60%（大新），其他營養(yǎng)類型如病理寄生-腐生-共生（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）、病理寄生（Pathotroph）和病理寄生-共生（Pathotroph-Symbiotroph）的真菌群落則比較少，相對豐度均少于2%；兩地的根際土壤真菌群落的營養(yǎng)類型基本類似，其中大新病理寄生-腐生-共生的相對豐度占17%、腐生和共生約占4%，龍州共生和

病理寄生-腐生-共生的相對豐度分別占14.43%和13.31%。從功能類型上分析，兩地毛唇芋蘭均主要由外生菌根（ectomycorrhizal）功能群構(gòu)成，并且以瘤菌根菌屬真菌群為核心真菌組；其他功能群包括未定義腐生菌群（undefined saprotroph）、動物病原菌（animal pathogen）、叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza）、內(nèi)生菌根-植物病原菌-未定義腐生菌群（Endomycorrhizal-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）等，它們的相對豐度均比較低，這反映了毛唇芋蘭根內(nèi)和根際真菌的多樣性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩地毛唇芋蘭根際土壤中的OTU總數(shù)均比根中的高，同時兩地根際土壤和根中也存在共同的OTU。這表明蘭科植物根際土壤中的真菌類群要多于根中，并且兩地蘭科植物根際土壤和根中存在相同的真菌群落。蔣玉玲等（2019）在研究綬草等9種蘭科植物過程中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，認(rèn)為蘭科植物根際真菌的組成要比根中真菌的組成更復(fù)雜。大新和龍州兩地毛唇芋蘭根際土壤的優(yōu)勢菌門組成與含量存在顯著差異，前者的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，后者為擔(dān)子菌門。在兩地毛唇芋蘭根中，子囊菌的物種豐度存在顯著差異，被孢霉門真菌在LZZG與DXZG之間的物種豐度存在顯著差異，這些結(jié)果表明毛唇芋蘭根系真菌與根際土壤真菌的組成均很豐富，但它們在不同部位及不同區(qū)域之間的真菌組成、結(jié)構(gòu)及相對豐度上存在一定的差異。這種差異與外界環(huán)境因子，如海拔高度（徐玲玲等，2019）、土壤濕度、酸堿度及營養(yǎng)條件（Ogura-Tsujita & Yukawa，2008；Bunch et al.，2013；Jacquemyn et al.，2015）和季風(fēng)氣候（馬雪亭等，2016）及植被類型（Lin et al.， 2020）等對蘭科植物真菌群落組成的影響有關(guān)。

總之，高通量測序等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為高效、全面分析蘭科植物毛唇芋蘭根系共生真菌組成提供了有效手段，也為進(jìn)一步有針對性地分離培養(yǎng)可培養(yǎng)的菌根真菌，用于研究蘭科種子共生萌發(fā)和菌根共生作用機制等提供了科學(xué)參考，這對采用菌根技術(shù)解決毛唇芋蘭瀕危植物資源保護(hù)和可持續(xù)利用具有非常重要的實踐意義。然而，本研究雖然從毛唇芋蘭根系和根際土壤中獲得大量的序列，但由于NCBI數(shù)據(jù)庫比對數(shù)據(jù)的不足，因此無法全部將這些生物信息解讀出來，這對本研究的全面分析產(chǎn)生了一定的干擾，這部分工作還有待進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)：

BUNCH WD， COWDEN CC， WURZBURGER N， et al.， 2013. Geography and soil chemistry drive the distribution of fungal associations in ladys slipper orchid， Cypripedium acaule ［J］. Botany， 91（12）： 850-856.

CHEN J， MENG ZX， XING YM， et al.， 2017. Isolation and identification of endophytic fungi from five medicinal plants species of Orchidaceae ［J］. Chin Pharm J， 52（4）： 267-271.? ［陳娟， 孟志霞， 邢詠梅， 等， 2017. 5種蘭科藥用植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的鑒定及多樣性分析 ［J］. 中國藥學(xué)雜志， 52（4）： 267-271.］

CHEN YH， XING XK， GUO SX， 2017. Nutritional relationships between orchids and mycorrhizal fungi： a review ［J］. Mycosystema， 36（7）： 807-819.? ［陳艷紅， 邢曉科， 郭順星， 2017. 蘭科植物與菌根真菌的營養(yǎng)關(guān)系 ［J］. 菌物學(xué)報， 36（7）： 807-819.］

CHEN YH， XING XK， GUO SX， 2018. The endophytic fungal community composition of Gymnadenia conopsea in Beijing ［J］. Mycosystema， 37（1）： 35-42.? ［陳艷紅， 邢曉科， 郭順星， 2018. 北京地區(qū)手參內(nèi)生真菌的區(qū)系組成分析 ［J］. 菌物學(xué)報， 37（1）： 35-42.］

FAY MF， 2016. Orchid conservation： further links ［J］. Ann Bot， 118（1）： 89-91.

FU YJ， ZHANG JL， HOU XQ， 2019. Comparative analysis of fungi diversity in rizospheric and non-rhizospheric soil from Cypripedium macranthum estimated via high-throughput sequencing ［J］. Acta Agric Boreal-Occident Sin， 28（2）： 253-259.? ［付亞娟， 張江麗， 侯曉強， 2019. 大花杓蘭根際與非根際土壤真菌多樣性的高通量測序分析 ［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報， 28（2）： 253-259.］

HUANG MQ， XIE YL， LAI XP， et al.， 2012. Protection of total flavonoid fraction from Nervilia fordii on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats ［J］. Chin Med Mat， 4（4）： 287-293.

JACQUEMYN? H， BRYS R， WAUD M， et al.， 2015. Mycorrhizal networks and coexistence in species-rich orchid communities ［J］. New Phytolt， 206（3）： 1127-1134.

JACQUEMYN H， MERCKX V， BRYS R， et al.， 2011. Analysis of network architecture reveals phylogenetic constraints on mycorrhizal specificity in the genus Orchis （Orchidaceae）? ［J］. New Phytol， 192： 518-528.

JIANG YL， CHEN XH， MIAO Q， et al.， 2019. Difference in fungal communities between in roots and in root-associated soil of nine orchids in Liaoning， China ［J］. Chin J Plant Ecol， 43（12）： 1079-1090. ［蔣玉玲， 陳旭輝， 苗青， 等， 2019. 遼寧省9種蘭科植物根內(nèi)與根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異 ［J］. 植物生態(tài)學(xué)報， 43（12）： 1079-1090.］

LIANG YS， GONG L， HUANG ZH， et al.， 2017. Analysis of global ecological suitability of southern Chinese materia medica herba Nervilia fordii ［J］. Subtrop Plant Sci， 46（4）： 339-342.? ［梁永樞， 宮璐， 黃志海， 等， 2017. 南藥青天葵全球產(chǎn)地生態(tài)適宜性分析 ［J］. 亞熱帶植物科學(xué)， 46（4）： 339-342.］

LIN M， XIONG H， XIANG X， et al.， 2020. The effect of plant geographical location and developmental stage on root-associated microbiomes of Gymnadenia conopsea ［J］. Front Microbiol， 11（1257）： 1-17.

MA XT， XING XK， GUO SX， 2016. Correlation between distribution of Dendrobium chrysotoxum and mycorrhizal fungal community composition ［J］. Mycosystema， 35（7）： 814-821.? ［馬雪亭， 邢曉科， 郭順星， 2016. 鼓槌石斛的地理分布與菌根真菌區(qū)系組成的相關(guān)性 ［J］. 菌物學(xué)報， 35（7）： 814-821.］

MCCORMICK MK， JACQUEMYN H， 2014. What constrains the distribution of orchid populations？? ［J］. New Phytol， 202（2）： 392-400.

MCCORMICK MK， TAYLOR DL， WHIGHAM DF， et al.， 2016. Germination patterns in three terrestrial orchids relate to abundance of mycorrhizal fungi ［J］. J Ecol， 104（3）： 744-754.

MEI QX， 2008. Advance in the research of chemical constituent pharmacologic action and clinical application of Herba Nerviliae Plicatae ［J］. Chin Arch Trad Chin Med， 26（10）： 2239-2241.? ［梅全喜， 2008. 青天葵的化學(xué)成分藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 ［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 26（10）： 2239-2241.］

MENG YY， ZHANG WL， SELOSSE MA， et al.， 2019. Are fungi from adult orchid roots the best symbionts at germination？ A case study ［J］. Mycorrhiza， 2019， 29（5）： 541-547.

OGURA-TSUJITA Y， YUKAWA T， 2008. High mycorrhizal specificity in a widespread mycoheterotrophic plant， Eulophia zollingeri （Orchidaceae） ［J］. Am J Bot， 95（1）： 93-97.

OKTALIRA FT， WHITEHEAD MR， LINDE CC， 2019. Mycorrhizal specificity in widespread and narrow-range distributed Caladenia orchid species ［J］. Fungal Ecol， 42（C）： e100869.

PANG MX， JIN G， HUANG ZL， et al.， 2021. Diversity of fungi associated with Caulerpa lentillifera in the South China Sea ［J］. Mycosystema， 40（8）： 2171-2180.? ［龐美霞， 金剛， 黃志立， 等， 2021. 南海長莖葡萄蕨藻共附生真菌的多樣性 ［J］. 菌物學(xué)報， 40（8）： 2171-2180.］

QIU L， XU LY， MAO JH， et al.， 2011. Study advances on chemical constituents from Nervilia fordii （Hance） Schltr. and its bioactivities ［J］. Lishizhen Med Mat Med Res， 22（9）： 2258-2260.? ［邱莉， 徐靈源， 繆建華， 等， 2011. 青天葵植物化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展 ［J］. 時珍國醫(yī)國藥， 22（9）： 2258-2260.］

RAFTER M， YOKOYA K， SCHOFIELD EJ， et al.， 2016. Non-specific symbiotic germination of Cynorkis purpurea （Thouars） Kraezl.， a habitat-specific terrestrial orchid from the Central Highlands of Madagascar ［J］. Mycorrhiza， 26（6）： 541-552.

RASMUSSEN HN， RASMUSSEN FN， 2009. Orchid mycorrhiza： implications of a mycophagous life style ［J］. Oikos， 118（3）： 334-345.

SCHLOSS PD， WESTCOTT SL， RYABIN T， et al.， 2009. Introducing mothur： open-source， platform-independent， community-supported software for describing and comparing microbial communities ［J］. Appl Environ Microbiol， 5（23）： 7537-7541.

WANG XG， LI XL， DONG Y， et al.， 2021. Difference in fungal communities between in roots and in rhizospheric soil of Paphiopedilum hirsutissimum ［J］. SW Chin J Agric， 34（4）： 762-769. ［王曉國， 李秀玲， 董艷， 等， 2021. 帶葉兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌群落組成分析 ［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 34（4）： 762-769.］

WAUD M， WIEGAND T， BRYS R， et al.， 2016. Nonrandom seedling establishment corresponds with distance-dependent decline in mycorrhizal abundance in two terrestrial orchids ［J］. New Phytol， 211（1）： 255-264.

XIONG D， OU J， LI LP， et al.， 2020. Community composition and ecological function analysis of endophytic fungi in the roots of Rhododendron simsii in Pinus massoniana forest in central Guizhou ［J］. Acta Ecol Sin， 40（4）： 1228-1239.? ［熊丹， 歐靜， 李林盼， 等， 2020. 黔中地區(qū)馬尾松林下杜鵑根部內(nèi)生真菌群落組成及其生態(tài)功能 ［J］. 生態(tài)學(xué)報， 40（4）： 1228-1239.］

XU LL， ZHAO MY， LI J， et al.， 2019. Correlation between vertical distribution of three Cypripedium species and composition of orchid mycorrhizal fungal community ［J］. Mycosystema， 38（6）： 811-821.? ［徐玲玲， 趙明陽， 李菁， 等， 2019. 不同海拔的三種杓蘭屬植物與菌根真菌群落組成相關(guān)性 ［J］. 菌物學(xué)報， 38（6）： 811-821.］

YUAN L， YANG ZL， LI SY， et al.， 2010. Mycorrhizal specificity， preference， and plasticity of six slipper orchids from South Western China ［J］. Mycorrhiza， 20（8）： 559-568.

（責(zé)任編輯 蔣巧媛 鄧斯麗）

收稿日期：? 2022-02-28

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（31860128）; 廣西自然科學(xué)基金（2019GXNSFDA245017）; 廣西中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202010600176; S2021110600121）; 2022年廣西中醫(yī)藥科技成果轉(zhuǎn)化與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心項目（0502200903）; 廣西壯瑤藥重點實驗室（桂科基字［2014］32號）。

第一作者： 譚小明（1979-），博士，研究員，主要從事珍稀藥用植物和藥用真菌資源研究與利用，（E-mail）txm1978@126.com。

通信作者：? 周雅琴，副主任藥師，主要從事藥用植物內(nèi)生真菌活性成分研究，（E-mail） zhouyaqin2009@126.com。