牡丹野生種根際土壤細(xì)菌群落特征分析

郭麗麗,張晨潔,王 菲,沈佳佳,張凱月,何麗霞,郭 琪,侯小改*

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,甘肅 蘭州 730020)

牡丹(Paeonia×suffruticosa)屬芍藥科芍藥屬牡丹組(Sect.Moutan)多年生木本植物。根據(jù)花盤質(zhì)地和形態(tài)可分為革質(zhì)花盤亞組和肉質(zhì)花盤亞組,革質(zhì)花盤亞組包括1個(gè)栽培種牡丹和5個(gè)野生種,即卵葉牡丹(P.qiui)、稷山牡丹(P.jishanensis)、楊山牡丹(P.ostii)、紫斑牡丹(P.rockii)、四川牡丹(P.decomposita);肉質(zhì)花盤亞組包括4個(gè)野生種,即紫牡丹或稱滇牡丹(P.delavayi)、黃牡丹(P.lutea)、狹葉牡丹(P.potanini)和大花黃牡丹(P.ludlowii)[1]。牡丹組的9個(gè)野生種均為我國(guó)特有種[1],是雜交育種的親本來(lái)源[2],在系統(tǒng)演化、生物多樣性保護(hù)、新品種培育和改良等研究中具有重要作用,同時(shí)也具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值與科學(xué)研究?jī)r(jià)值[3-6]。

根際是土壤、根系以及微生物三者之間相互作用的關(guān)鍵區(qū)域[7],根際土壤微生物數(shù)量龐大,群落豐富且功能多樣[8],在促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-11]。在環(huán)境變化、人為干擾等多因素的影響下,根際土壤微生物群落常處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程中[12],其與植物之間的相互作用在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮積極作用,能夠提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和抗性[13]。因此,探究根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成有利于理解土壤生態(tài)系統(tǒng)對(duì)植物生長(zhǎng)和健康的影響[14]。

目前,關(guān)于牡丹根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)較少,而且主要集中在栽培品種上,如耿曉東等[15]發(fā)現(xiàn)不同種植年限‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)根際真菌群落多樣性表現(xiàn)為6年生>3年生>10年生;李昱瑩等[16]報(bào)道了不同種植年限‘鳳丹’根際土壤真菌群落多樣性為10年生>5年生>32年生>4年生>2年生,而‘鳳丹’根際土壤細(xì)菌多樣性則隨種植年限的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)[17]。此外,牡丹根際土壤中微生物總數(shù)量大于非根際土壤,其中細(xì)菌占主要優(yōu)勢(shì)[18]。Xue等[19]報(bào)道了牡丹種植年限和栽培品種對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。Yang等[5]對(duì)牡丹根和葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明‘雪蓮’(P.rockii‘Xuelian’)、‘花王’(P.suffruticosa‘Kaoh’)和‘正午’(P.suffruticosa×P.delavayivar.lutea‘High Noon’)牡丹根內(nèi)細(xì)菌的OTU豐度高于葉內(nèi),優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)種源地四川牡丹根際土壤微生物和種子內(nèi)生菌的組成研究發(fā)現(xiàn),同一種源地根際土壤和種子中有70%以上的相同細(xì)菌序列,而相同的真菌序列最高約50%,且土壤有機(jī)碳、氮、磷含量等性質(zhì)均會(huì)對(duì)根際土壤微生物及內(nèi)生菌的組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響[20]。大量研究表明牡丹根際微生物對(duì)維持牡丹健康和土壤肥力具有重要的生態(tài)學(xué)意義[5, 19, 21-23]。然而,牡丹野生種根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)合MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法,對(duì)引種地的9個(gè)牡丹野生種根際土壤細(xì)菌群落特征進(jìn)行分析,探究其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系,旨在挖掘和培育有利于牡丹野生種健康生長(zhǎng)的根際微生物菌群,為開(kāi)展牡丹種質(zhì)資源保護(hù)、新品種培育和種質(zhì)創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牡丹野生種基本信息

本研究選取9個(gè)牡丹野生種,分別于1992年(大花黃牡丹)、1998年(稷山牡丹、紫斑牡丹、四川牡丹、狹葉牡丹、紫牡丹和黃牡丹)和1999年(卵葉牡丹和楊山牡丹)從西藏林芝、山西稷山縣、甘肅子午嶺林區(qū)、四川馬爾康縣、四川雅江縣、云南麗江、云南中甸縣、湖北神農(nóng)架和河南楊山引種到甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站(103°88′E,36°05′N),并采用統(tǒng)一的施肥、灌溉等措施對(duì)其進(jìn)行日常管理。

1.2 根際土壤的采集

本研究所用的9種牡丹的根際土壤樣品于2019年采自甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站。牡丹根際土壤采集方法參考Han等[24]方法,即每個(gè)野生種隨機(jī)選取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株,去除土壤表層植物殘?bào)w,在每株牡丹主莖四周10 cm處利用土鉆采集5個(gè)樣點(diǎn)的土壤,每個(gè)采樣點(diǎn)取1芯(直徑5 cm,深度20 cm)。混勻后按四分法收集約200 g根際土壤并分為兩份,其中一份置于-80 ℃冰箱保存,用于微生物群落特征的分析;另一份置于室內(nèi)風(fēng)干,用于土壤性質(zhì)測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用EZNA?Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek,USA)對(duì)采集的27份根際土壤樣品進(jìn)行微生物組總DNA的提取,通過(guò)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)(IMPLEN,德國(guó))檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度,高質(zhì)量DNA樣品置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以?xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)域338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)為引物[25],微生物總DNA為模板,使用Phusion酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系如下:Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL、引物338F和806R各2.5 μL、DNA模板50 ng、加ddH2O至25 μL;反應(yīng)條件為98 ℃ 30 s、98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min,4 ℃保存。通過(guò)PCR在目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物上添加測(cè)序通用接頭和樣本特異性Barcode序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),使用AMPure XT beads回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收,具體步驟參考試劑盒中的操作說(shuō)明。

1.3.2 高通量測(cè)序

純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量、混庫(kù)。利用Illumina測(cè)序平臺(tái)250 PE(杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司)及按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

在特定的過(guò)濾條件下對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾,使用Vsearch軟件(V2.3.4)過(guò)濾嵌合體序列并進(jìn)行質(zhì)控分析,獲得最終數(shù)據(jù)。使用Blast分類比對(duì)軟件進(jìn)行物種分析,使用UPARSE 8.0按照相似度97%將序列聚類成操作分類單元(OTUs),通過(guò)核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目(RDP)分類器將分類注釋分配給每個(gè)OTU的代表性序列。所獲得的細(xì)菌16S rRNA基因序列保存在國(guó)家生物技術(shù)信息序列讀取檔案中心(登記號(hào)PRJNA760268)。

1.3.4 根際土壤性質(zhì)的測(cè)定

根際土壤樣品經(jīng)風(fēng)干后,分別過(guò)0.150和0.850 mm篩以供土壤指標(biāo)的測(cè)定。使用土壤酸堿度計(jì)進(jìn)行土壤pH的測(cè)定,土壤有機(jī)質(zhì)含量(soil organic matter,SOM)采用重鉻酸鉀滴定法測(cè)定,全氮含量(total nitrogen,TN)采用半微量開(kāi)氏法測(cè)定,速效磷含量(available phosphorous,AP)采用0.5 mol/L NaHCO3浸提和鉬銻抗比色法測(cè)定,速效鉀含量(available kalium,AK)采用1 mol/L的NH4OAc浸提和火焰光度法測(cè)定[26]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)9個(gè)牡丹野生種根際土壤細(xì)菌的Alpha多樣性(Chao1豐富度估計(jì)量、物種豐富度指數(shù)、測(cè)序深度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù))進(jìn)行分析,以表示細(xì)菌種群的豐富度、多樣性、優(yōu)勢(shì)度和均勻度。采用SPSS 26.0進(jìn)行Beta多樣性分析,其基于距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)以評(píng)價(jià)細(xì)菌群落的差異。采用OmicStudio(https://www.omicstudio.cn/tool)工具進(jìn)行LEfSe(LDA Effect Size)分析用于驗(yàn)證樣本中不同根際土壤細(xì)菌類群的差異性。利用OmicStudio工具中PICRUSt2功能預(yù)測(cè)云分析對(duì)9個(gè)野生種根際土壤細(xì)菌群落的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

采用SPSS 26.0對(duì)土壤性質(zhì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素(One-way ANOVA)方差分析,通過(guò)新復(fù)極差法(Duncan)來(lái)比較各處理間差異的顯著性,使用OmicStudio工具對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相對(duì)豐度和土壤性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析和冗余分析(redundancy analysis,RDA)并作圖,利用Origin 2018進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹野生種根際土壤性質(zhì)特征

由牡丹根際土壤的性質(zhì)(表1)可知,牡丹野生種在其引種地根際土壤pH分布在8.16～8.44,其中楊山牡丹根際土壤pH最高,與其他種呈顯著差異(P<0.05);其次是狹葉牡丹、四川牡丹、紫斑牡丹、稷山牡丹和大花黃牡丹;黃牡丹、卵葉牡丹和紫牡丹的根際土壤pH最小,且與狹葉牡丹根際存在顯著差異(P<0.05)。9種野生牡丹根際土壤有機(jī)質(zhì)含量不同,四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤有機(jī)質(zhì)含量最高,黃牡丹、狹葉牡丹和稷山牡丹根際土壤含有的有機(jī)質(zhì)最少,前兩種與后3種間存在顯著差異(P<0.05)。四川牡丹和黃牡丹根際土壤全氮含量最高,且顯著高于紫斑牡丹和狹葉牡丹(P<0.05)。根際土壤速效磷含量表現(xiàn)為黃牡丹>卵葉牡丹>楊山牡丹>大花黃牡丹>狹葉牡丹>紫斑牡丹>四川牡丹>稷山牡丹>紫牡丹。大花黃牡丹根際土壤中速效鉀含量最高,顯著高于其他種;其次為黃牡丹與紫牡丹,顯著高于除大花黃牡丹外的其他種;卵葉牡丹和狹葉牡丹根際土壤中速效鉀含量顯著低于除楊山牡丹外的其他種(P<0.05)。

表1 牡丹野生種根際土壤的理化性質(zhì)

2.2 根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成

9個(gè)牡丹野生種根際土壤細(xì)菌16S rDNA測(cè)序共獲得606 536個(gè)原始序列片段,共計(jì)247.71 Mb。其中長(zhǎng)度小于200 bp序列片段有3 997條,≥200～300、≥300～400、≥400～500 bp分別有5 558、165 721、431 260條。這些序列依次聚類到3 168、2 604、1 903、1 713、3 702、3 217、580、853和2 291個(gè)OTU單元。

2.2.1 多樣性分析

在相似性≥97%的水平上對(duì)各樣品的有效序列進(jìn)行OTU聚類,篩選出OTUs的代表性序列,共獲得60 092個(gè)OTUs,并利用R程序制作花瓣圖(圖1)。由圖1可知,9個(gè)野生種樣品所含OTU數(shù)目均由特異OTU數(shù)目和共有OTU數(shù)目組成,重疊區(qū)包含377個(gè)共有OTU數(shù)目。各樣品所含特異OTU數(shù)目以稷山牡丹最多(114個(gè)),四川牡丹最少(18個(gè))。

圖1 牡丹野生種根際土壤樣品的OTU分析Fig.1 OTU analysis of rhizosphere soil samples of wild tree peony

對(duì)牡丹土壤根際細(xì)菌群落進(jìn)行Alpha多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表2。Chao1豐富度估計(jì)量和物種豐富度指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息,估計(jì)群落中包含物種的數(shù)目,由表2中Chao1和物種豐富度結(jié)果可知,9個(gè)牡丹野生種中楊山牡丹根際土壤細(xì)菌群落包含的物種數(shù)目最高,紫牡丹和稷山牡丹兩個(gè)種根際土壤樣本中物種數(shù)目含量最少,與除卵葉牡丹外的其他種間存在顯著性差異(P<0.05)。Shannon和Simpson多樣性指數(shù)同時(shí)反映樣品中物種種類的數(shù)目,以及樣品中不同種類的物種豐度的平均性或均勻性,在相同的測(cè)序深度下,狹葉牡丹、楊山牡丹、四川牡丹、大花黃牡丹、紫斑牡丹和黃牡丹根際土壤細(xì)菌的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)較高,且與紫牡丹和稷山牡丹差異顯著,表明6個(gè)牡丹野生種多樣性較其他種更高。測(cè)序深度指數(shù)能夠反映樣本低豐度OTU覆蓋情況,9個(gè)樣本的數(shù)值均大于0.85,表明測(cè)序深度已基本覆蓋到樣品中所有種,樣本所構(gòu)建的細(xì)菌文庫(kù)能夠比較有效地反映其多樣性。

表2 牡丹野生種根際土壤樣品的Alpha多樣性分析

通過(guò)PCoA(圖2)分析發(fā)現(xiàn),各樣本細(xì)菌群落組成具有明顯差異。其中四川牡丹、紫斑牡丹、黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹和大花黃牡丹分布距離較近,說(shuō)明其根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似;稷山牡丹、紫牡丹和卵葉牡丹與其他6組分布距離較遠(yuǎn),表明三者根際土壤中細(xì)菌群落差異顯著。

圖2 基于Weight-UniFrac方法的牡丹野生種根際土壤樣品PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of rhizosphere soil samples of wild tree peony based on the Weight-UniFrac method

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

基于OTU分類結(jié)果,9個(gè)牡丹野生種根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列被分為24門、84綱、154目、280科和603屬。

9個(gè)牡丹野生種根際土壤樣本的細(xì)菌群落微生物多樣性的整體分布結(jié)果表明:在門水平上(表3),根際土壤樣本的核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落主要由變形菌門(Proteobacteria,相對(duì)豐度9.35%～34.20%)、酸桿菌門(Acidobacteria,相對(duì)豐度12.59%～35.61%)、放線菌門(Actinobacteria,相對(duì)豐度9.07%～42.13%)和綠彎菌門(Chloroflexi,相對(duì)豐度3.12%～17.44%)組成,總占比為79.96%,剩下的14.21%涉及19個(gè)門。其中,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,相對(duì)豐度0.53%～4.71%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,相對(duì)豐度1.06%～5.49%)、厚壁菌門(Firmicutes,相對(duì)豐度0.58%～12.83%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae,相對(duì)豐度0.28%～2.58%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,相對(duì)豐度0.38%～1.72%)也表現(xiàn)出了較高的相對(duì)豐度。有5.83%的序列在門水平上不能進(jìn)行分類。

在門水平上的單因素方差分析結(jié)果表明,不同細(xì)菌在不同牡丹野生種根際土壤中豐度存在顯著差異。變形菌門在紫牡丹和稷山牡丹中豐度顯著低于除卵葉牡丹外的其他種(P<0.05);酸桿菌門在四川牡丹中豐度最高,在紫牡丹和稷山牡丹中豐度較低,兩者存在顯著差異(P<0.05);紫牡丹和稷山牡丹中放線菌門豐度顯著高于除卵葉牡丹外的其他種(P<0.05);綠彎菌門在紫牡丹中豐度最高(P<0.05),和四川牡丹、黃牡丹根際中豐度存在顯著差異(P<0.05);四川牡丹、楊山牡丹和狹葉牡丹中芽單胞菌豐度較高,與紫牡丹和稷山牡丹存在顯著差異(P<0.05);擬桿菌門在大花黃牡丹根際土壤中豐度最高,在卵葉牡丹、稷山牡丹和紫牡丹中豐度較低,前者與后三者間存在顯著差異(P<0.05);厚壁菌門在稷山牡丹中豐度最高,與其他8個(gè)種差異顯著(P<0.05);硝化螺旋菌門在大花黃牡丹根際土壤中豐度最高,在紫牡丹中豐度最低;疣微菌門在紫斑牡丹中豐度最高,在四川牡丹和稷山牡丹中豐度最低,差異顯著(P<0.05)。

2.3 牡丹9個(gè)野生種根際土壤細(xì)菌差異分析

LEfSe分析結(jié)果(圖3)表明,四川牡丹根際細(xì)菌群落中硝化螺旋菌門、酸桿菌門、貪銅菌屬(Cupriavidus)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、Gp22、Gp4、Gp17和Gp4等相對(duì)豐度較高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;紫牡丹中綠彎菌門、放線菌門、小單孢菌屬(Micromonospora)、暖繩菌屬(Caldilinea)等存在顯著差異;在大花黃牡丹中起到重要作用的細(xì)菌類別為硝化螺旋菌門、黃桿菌屬(Flavobacterium)、嗜熱光合細(xì)菌屬(Roseiflexus)、根瘤菌屬(Chelativorans)和Gp3;黃牡丹中起到重要作用的細(xì)菌為變形菌門、甲基彎菌屬(Methylosinus)和假單胞菌屬(Pseudomonas);楊山牡丹中為芽單胞菌門;卵葉牡丹中馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)相對(duì)豐度較高。

不同的圈層從內(nèi)向外輻射,代表物種的7個(gè)分類級(jí)別,每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表該級(jí)別下的物種分類;彩帶的顏色代表植物種;不同節(jié)點(diǎn)的字母代表的具體細(xì)菌種類標(biāo)記在圖的右側(cè)。Different circles radiate from inside to outside, representing seven classification levels of species, and each node represents the classification of species under this level; the color of the ribbon represents the plant species; the bacterial species represented by the letters of different nodes are marked on the right side of the figure.

2.4 牡丹9個(gè)野生種根際土壤細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

利用PICRUSt軟件進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)。選取豐度排名前35的第3層級(jí)功能及它們?cè)诿總€(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖(圖4)。不同樣本根際細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)多集中在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理相關(guān)通路上,如轉(zhuǎn)錄因子、一般功能預(yù)測(cè)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、DNA修復(fù)和重組蛋白、雙組分系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)、核糖體、嘌呤代謝、未知功能、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、肽酶、嘧啶代謝、氨基酸相關(guān)酶、染色體、核糖體合成、其他離子偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氧化磷酸化、精氨酸和脯氨酸代謝、丙酮酸代謝、原核生物中的碳固定途徑等。與紫牡丹、黃牡丹和大花黃牡丹相比,楊山牡丹根際細(xì)菌中差異功能最為顯著,狹葉牡丹次之。

色帶相應(yīng)顏色與熱圖矩陣數(shù)據(jù)相映射,靠近正值顏色(紅色)即為正相關(guān),靠近負(fù)值顏色(藍(lán)色)即為負(fù)相關(guān)。The corresponding color of the color band is mapped to the heat map matrix data, and the color close to the positive value (red) is positive correlation and the color close to the negative value (blue) is negative correlation.

2.5 土壤環(huán)境因子與根際土壤細(xì)菌群落的關(guān)系

相關(guān)性分析(圖5)發(fā)現(xiàn),牡丹根際土壤有機(jī)質(zhì)含量與細(xì)菌中變形菌門、酸桿菌門、匿桿菌門和纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與芽單胞菌門和硝化螺旋菌門相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05);與放線菌門、綠彎菌門和candidatus Saccharibacteria相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與厚壁菌門(Tenericutes)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。土壤速效鉀含量與擬桿菌門相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與變形菌門和硝化螺旋菌門相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05);與放線菌門呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

**.P<0.01;*.P<0.05;色帶相應(yīng)顏色與熱圖矩陣數(shù)據(jù)相映射,靠近正值顏色(紅色)即為正相關(guān),靠近負(fù)值顏色(藍(lán)色)即為負(fù)相關(guān)。The corresponding color of the color band is mapped to the heat map matrix data, and the color close to the positive value (red) is a positive correlation and the color close to the negative value (blue) is a negative correlation.

冗余分析(圖6)表明,第一、二排序軸分別解釋了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的0.687%和37.640%。5個(gè)環(huán)境因子分布在3個(gè)象限中,其中pH落在第一象限,與落在第二、三象限的4種土壤環(huán)境因子(全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量)呈負(fù)相關(guān)。9個(gè)牡丹野生種根際土壤微生物中放線菌門和綠彎菌門與pH因子呈正相關(guān),與全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān);酸桿菌門和變形菌門與全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān),與pH呈負(fù)相關(guān)。9個(gè)牡丹野生種與環(huán)境因子的箭頭越近,表明其與該環(huán)境因子的正相關(guān)性越大,反之負(fù)相關(guān)性越大。四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤微生物與土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量呈正相關(guān);黃牡丹、楊山牡丹和大花黃牡丹的土壤根際微生物與土壤全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān);狹葉牡丹的土壤根際微生物與土壤速效鉀和速效磷含量呈正相關(guān);紫牡丹的根際土壤微生物與土壤pH呈顯著正相關(guān)。

紅色箭頭表示環(huán)境因子,藍(lán)色箭頭表示門水平上根際土壤細(xì)菌(top 4),長(zhǎng)短代表其在排序空間內(nèi)的變化量,箭頭所處象限代表其與排序軸之間相關(guān)性的正負(fù)。The red arrows represent environmental factors, the blue arrows represent rhizosphere soil bacteria (top 4) at the phylum level, the length represents its variation in the sorting space, and the quadrants where the arrows are located represent the positive and negative correlations between them and the sorting axis. A. 四川牡丹P. decomposita; B. 紫斑牡丹P. rockii; C. 黃牡丹P. lutea; D. 卵葉牡丹P. qiui; E. 楊山牡丹P. ostii; F. 狹葉牡丹P. potanini; G. 紫牡丹P. delavayi; H. 稷山牡丹P. jishanensis; I. 大花黃牡丹P. ludlowii. 數(shù)字表示重復(fù)。The number represents repetition. pH. 酸堿度potential of hydrogen; SOM. 有機(jī)質(zhì)soil organic matter; TN. 全氮total nitrogen; AP. 速效磷available phosphorous; AK. 速效鉀available K.Proteobacteria.變形菌門;Acidobacteria .酸桿菌門;Actinobacteria.放線菌門; Chloroflexi.綠彎菌門。

3 討 論

野生植物種質(zhì)資源的保護(hù)及利用是育種工作者面臨的重要問(wèn)題之一,不僅要收集和保護(hù)野生種質(zhì)資源,還要通過(guò)不斷研究將其合理地利用到育種中[27]。根際土壤微生物群落作為根際微生物系統(tǒng)的重要組成部分,驅(qū)動(dòng)著土壤系統(tǒng)中各種生物進(jìn)程,能夠分解有機(jī)物,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用[28-29]。微生物在根際大量繁殖,構(gòu)成一個(gè)旺盛的生物活動(dòng)區(qū),對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有很大影響,例如,加快有機(jī)質(zhì)的分解、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化、刺激植物的生長(zhǎng)、避免土傳病原菌的侵染等[30]。本研究采集了9個(gè)牡丹野生種根際土壤樣品,分析其理化特性,并利用分子生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究。9個(gè)牡丹野生種分別于1992年、1998年和1999年引種到甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)20多年的統(tǒng)一管理和馴化,已適應(yīng)引種地的生長(zhǎng)環(huán)境[31],其土壤細(xì)菌群落特征因受到不同種牡丹根系的影響而產(chǎn)生差異,具有種間可比性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊山牡丹根際土壤pH最高。孫曉剛等[32]在研究土壤pH對(duì)牡丹生長(zhǎng)和光合特性影響時(shí)發(fā)現(xiàn),不同pH的土壤對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的影響。然而在四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤中有機(jī)質(zhì)含量最高,在黃牡丹、狹葉牡丹和稷山牡丹根際土壤中含量最少,土壤有機(jī)質(zhì)具有提供植物生長(zhǎng)的各種養(yǎng)分,增強(qiáng)土壤的保水保肥能力和緩沖性等作用。氮磷鉀含量在9個(gè)種牡丹中存在差異。此外,9個(gè)牡丹野生種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成雖有一定的相似性,但也存在差異。9個(gè)野生種根際細(xì)菌數(shù)量最多的4個(gè)門分別為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門。這與李怡等[33]研究發(fā)現(xiàn)剛竹屬3個(gè)竹種根際土壤微生物土壤細(xì)菌群落相一致。Chen等[34]在高原淡水湖和上坡土壤細(xì)菌群落的研究中也得出相同的結(jié)果。對(duì)多種植物根際土壤細(xì)菌研究也發(fā)現(xiàn)上述菌門是優(yōu)勢(shì)菌門,表明植物根際土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌門組成具有高度相似性[35-39]。已有牡丹相關(guān)根際微生物研究表明,變形菌門和放線菌門是不同品種牡丹根際細(xì)菌群落中共有的優(yōu)勢(shì)菌門[17, 24]。除了這些具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的優(yōu)勢(shì)菌門外,牡丹野生種根際中還具有較高豐度的酸桿菌門和綠彎菌門,推測(cè)這和牡丹野生種耐酸和耐熱的生長(zhǎng)習(xí)性有關(guān)。

Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn),楊山牡丹根際細(xì)菌群落數(shù)目最高。Beta分析結(jié)果表明稷山牡丹、紫牡丹和卵葉牡丹根際微生物群落結(jié)構(gòu)與四川牡丹、紫斑牡丹、黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹和大花黃牡丹存在差異。上述結(jié)果表明不同牡丹野生種根際細(xì)菌群落的Alpha及Beta多樣性不同,且結(jié)構(gòu)和豐富度是動(dòng)態(tài)變化的。狹葉牡丹和四川牡丹產(chǎn)于四川西部,生長(zhǎng)在海拔2 800～3 700 m的山坡灌叢中;稷山牡丹分布于陜西延安,生長(zhǎng)在山坡疏林中;楊山牡丹為江南種,是中原牡丹品種群祖先之一。因此,推測(cè)根際菌群結(jié)構(gòu)可能與其適宜生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

差異分析發(fā)現(xiàn),牡丹野生種根際細(xì)菌群落中的酸桿菌門和亞硝化螺菌屬(四川牡丹)、綠彎菌門(狹葉牡丹)、硝化螺旋菌門(大花黃牡丹)、假單胞菌屬(黃牡丹)及芽單胞菌門(楊山牡丹)等有益菌種在生態(tài)系統(tǒng)中扮演耐酸、耐熱、礦化有機(jī)物等重要角色[40-43],今后有望分離有益菌種應(yīng)用于實(shí)踐,這些細(xì)菌在牡丹生長(zhǎng)過(guò)程中與其他植物一樣發(fā)揮著重要作用。基于PICRUSt2功能預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)不同樣本根際細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)多集中在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理相關(guān)通路上,表明野生種牡丹根際細(xì)菌在這些途徑和效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。土壤環(huán)境因子與根際土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性分析結(jié)果表明,對(duì)牡丹野生種根際細(xì)菌群落影響較大的土壤環(huán)境因子主要是有機(jī)質(zhì)和速效鉀。冗余分析結(jié)果表示,四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤細(xì)菌受土壤有機(jī)質(zhì)和全氮影響較大,黃牡丹、楊山牡丹和大花黃牡丹受土壤全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)影響,對(duì)狹葉牡丹影響較大的是土壤速效鉀和速效磷,對(duì)紫牡丹影響較大的是土壤pH。

4 結(jié) 論

本研究分析了9個(gè)牡丹野生種在其引種地的根際土壤理化特性,并利用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)探究了土壤細(xì)菌群落組成和物種豐度。土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷和速效鉀含量在不同種牡丹根際存在顯著差異。野生種根際土壤細(xì)菌群落組成和物種豐度非常豐富,但不同種間存在顯著差異。變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌門,相對(duì)豐度之和可達(dá)79.9%。酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門、亞硝化螺菌屬和假單胞菌屬等有益菌種在不同種間存在差異。根際細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)多集中在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理方面。對(duì)牡丹野生種根際細(xì)菌群落影響較大的土壤環(huán)境因子為有機(jī)質(zhì)和速效鉀。研究結(jié)果對(duì)有效利用微生物資源和保護(hù)野生植物種質(zhì)資源具有重要的理論意義,為改良牡丹野生種的土壤環(huán)境、實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源廣譜性種植奠定基礎(chǔ)。