補腎活血復方介導鈣轉運蛋白肌漿網(wǎng)上的心肌鈣轉運蛋白、受磷蛋白調節(jié)內質網(wǎng)應激緩解慢性心衰大鼠心肌損傷

鄒文聰 張艷 許瑞 尹文浩 劉賢嫻 申欣宜

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一種可由多種復雜多樣致病因素引起心臟結構功能改變,累積加劇引起的綜合癥,被形容為各種心血管疾病進展的“最后戰(zhàn)場”[1-2]。中國CHF的患病人數(shù)已達890萬,長期的用藥治療給患者及其家庭加重了經(jīng)濟負擔,也是公共社會健康衛(wèi)生亟待解決的難題[3]。盡管CHF發(fā)生和發(fā)展的機制不斷被探索,但CHF的致死率與再入院率仍居高不下,進一步提高CHF防治水平,探索CHF致病機制發(fā)現(xiàn)新的治療靶點的當前需要解決的重大挑戰(zhàn)。許多疾病的誘因均與內質網(wǎng)應激有關。近幾年研究發(fā)現(xiàn),CHF產生的首要病變機理與心肌內質網(wǎng)應激聯(lián)系緊密,心肌細胞缺血、缺氧或其他毒性影響時,導致心肌內質網(wǎng)調節(jié)Ca2+功能障礙,因此恢復心肌細胞正常機能狀態(tài)的最主要方法是通過改善內質網(wǎng)應激使Ca2+濃度保持在正常范圍內,心肌鈣轉運蛋白(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a,SERCA2a)、受磷蛋白(phospholamban,PLB)主要來負責完成一生理過程[4-5]。PLB為SERCA2a上游靶點,負責調控SERCA2a對Ca2+的攝取及釋放[6],PLB抑制SERCA2a發(fā)揮作用,同時也是β腎上腺素能瀑布鏈的主要組成部分,能刺激活化蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),鈣調激酶Ⅱ (calmodulin dependent protein kinase 2,CaMKII),磷酸化PLB,降低心肌細胞Ca2+濃度,使得心肌舒張;因此調控SERCA2a、PLB對鈣循環(huán)紊亂為治療心衰的最關鍵步驟[7]。所以心肌內質網(wǎng)應激愈加成為關注的熱點,干預SERCA2a、PLB調控內質網(wǎng)應激改善Ca2+循環(huán)穩(wěn)態(tài)可能成為治療CHF的切入點。

補腎活血復方是張艷教授治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗方,治療慢性心力衰竭效果顯著[8]。本方的補腎利水、養(yǎng)心活血理論源于對臨床CHF患者心悸、胸悶、乏力、低垂部水腫等癥狀觀察總結[9]。本課題通過觀察補腎活血復方對CHF大鼠的心臟功能結構改變以及SERCA2a、PLB蛋白干預表達情況,探討能量代謝生理過程在其中的調節(jié)作用機制,探索中藥治療CHF的新思路。

1 材料與方法

1.1實驗藥物

補腎活血復方成分:黃精20 g、菟絲子20 g、丹參20 g、益母草15 g、紅花10 g、三七3 g、黃芪20 g、人參10 g。按照前期高、中、低劑量實驗測試,最佳大鼠服用劑量: 9.2g/(kg·d),遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院煎藥中心提供?？ㄍ衅绽?25 mg×100片,上海旭東海普藥業(yè)有限公司提供,生產批號:H31020564。

1.2實驗動物

實驗動物為健康SD雄性大鼠[許可證號:SCXK(遼)2015-0001],60只、12周齡、體質量為(200±20)g。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心(清潔級)。溫度20～22℃,濕度(55±2)%,最高光照時間為12小時,晝夜交替,飲食自由。保持籠清潔,每2日清理1次。Co60滅菌飼料由沈陽茂華生物科技有限公司提供。

1.3造模方法

將模型組共45只進行造模。心衰造模的方式參照文獻[10]應用的方法:冠狀動脈結扎法進行造模,大鼠術后食量減半,并采用力竭式游泳每日進行一次。并于手術前一天禁止飲食,正常飲水,對每只大鼠進行稱量體質量并且記錄,配置10%水合氯醛麻醉劑,按照大鼠體質量0.3 g/L的比率,通過腹腔注射的方式麻醉,將麻醉成功的大鼠用剃毛刀去除胸部毛發(fā),四肢用皮筋固定于鼠臺,連通心電圖機,并記載手術前大鼠心電圖。橫切大鼠喉部在氣管處開口實施氣管插管,并連通大鼠呼吸機。調節(jié)大鼠呼吸機參數(shù),設置潮氣容量為6 mL呼吸頻率選擇80次/分鐘,呼吸方式比率2∶1。觀察大鼠呼吸狀態(tài),待呼吸穩(wěn)定后實施開胸操作,先用碘伏滅菌胸部位置,由大鼠的第4肋間由上至下切開肌肉與肋骨,用手術剪進行縱向剪開胸部,止血鉗鈍性剝離胸部肌肉,將自制的肋骨開放鉤將肋骨肌肉向外拉開,使胸腔呈現(xiàn)開放狀態(tài),四指并攏推擠大鼠背部,使心臟暴露出胸腔,將穿好的6號縫合線,在左側冠脈的左前降分支下約2 mm部位進行結扎,迅速將肋間隙、肌肉應用3號縫合線縫合。待心電圖出現(xiàn)Ⅱ導聯(lián)ST段明顯抬高(≥0.1 mV)提示實驗大鼠已患有心梗,實驗模型造模成功[11-12]?？瞻捉M實驗過程是對冠狀動脈只掛線而不結扎,其他過程均與心梗造模一樣。

從術后第二天開始,給大鼠進行防感染操作,腹腔注射青霉素鉀5萬單位/天,連續(xù)給藥注射1周。將術后大鼠飲食恢復術前飲食量喂養(yǎng)持續(xù)1周,第2周開始喂養(yǎng)大鼠的飼料減至常規(guī)量的一半,使大鼠勞力運動每日進行1次的力竭式游泳,時間連續(xù)堅持4周。4周力竭式游泳后進行各組的大鼠多普勒超聲心動圖檢查,顯示射血分數(shù)≤50%時代表CHF造模成功[13-14]。

1.4主要試劑、儀器

水合氯醛(Phygene公司,批號:PH1818);青霉素鉀(上海酶聯(lián)有限公司,批號:20211101);酶聯(lián)免疫試劑盒(四川新輝動物藥業(yè)有限公司,批號:ml1003242-C)。FX7202型心電圖機(日本福田公司);HX-300型小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);Vivid 7 Dimension型彩色多普勒超聲檢測儀(GE公司);1-13小型臺式離心機(美國Sigma公司);德國LeicaPJ-1A型烤片機(天津天利航空機電有限公司);MS-2000多媒體化生物信號記錄分析系統(tǒng)(龍飛達科技有限公司);Epoch酶標儀(infinite F50公司);超低溫冰箱DW-HL388零下86度;制冰機IMS-60;純水機ROB30;酶標儀Infinite F50;離心機高速冷凍5804R;離心機TDZ5-WS;電熱恒溫培養(yǎng)箱(南通滬南科學儀器有限公司)。

1.5分組與干預

采用9分法對大鼠進行染色編號,應用隨機數(shù)字表,由左自右隨機選取5個數(shù)字對應標記的大鼠,分在一籠,每籠5只,共12籠。隨機選取3籠為空白組,其余9籠為模型組。空白組大鼠術中死亡2只,存活13只。模型組死亡5只,存活40只,并使用隨機分表法進行分組,模型組與補腎活血復方組各13只、卡托普利組分配14只。每日對各組大鼠進行灌胃,空白組與模型組進行等量的生理鹽水灌胃,劑量:3 mL/次,2次/日;根據(jù)人的臨床劑量換算成大鼠等效劑量[15];卡托普利組予以卡托普利灌胃為:12.5 mg/kg,頻率:1次/日。由于補腎活血復方已經(jīng)用于臨床十余年,有顯著的臨床治療效果,并前期實驗高中低劑量結果得出最佳大鼠灌胃劑量為9.2 g/kg。補腎活血復方組予以補腎活血復方灌胃,頻率:1次/日,共連續(xù)給藥4周[16-18]。

1.6指標檢測

1.6.1 大鼠表征觀察 觀察大鼠造模前后表征的變化:毛發(fā)色澤變化、體型狀態(tài)、食欲增減、精神狀態(tài)、自主活動情況、有無咳喘哮鳴音等癥狀出現(xiàn)。

1.6.2 大鼠心功能檢測 大鼠完成力竭式游泳后,將大鼠靜脈麻醉,仰臥于鼠板上局部備皮,使用多普勒超聲檢測儀對大鼠分別進行心臟超聲檢測,儀器頻率選用13 MHz,深度為3.5 cm,速度為 200 mm/秒。記錄彩超顯示的舒張末期左心室內徑(left ventricular inner diameter at end-diastole, LVIDD)、收縮末期左心室內徑(left ventricular internal diameter at the end-systolic stage,LVIDS)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短分數(shù)(fractional shortening of the LV short axis,FS)、每分鐘心跳次數(shù)(heart rate,HR)指標。

1.6.3 N端腦鈉肽前體(N-terminalPro-brain natriuretic peptide,NT-ProBNP)含量檢測 完成心功能檢測第二日上午,處死大鼠進行取材實驗,取鼠動脈血約2 mL,放置常溫待自然凝固10分鐘,放置于離心機離心,調節(jié)轉數(shù) 2500 r/分鐘,時間選擇10分鐘,吸取上清液,放置于-80℃冰箱保存,集中測試。具體操作步驟依據(jù)NT-ProBNP試劑盒說明書:穩(wěn)定至室溫時,向反應板孔中加入標準品與標本各100 μL,輕輕搖勻后,放在 20～25℃的恒溫箱中孵育20分鐘;清洗反應板,在對應孔中加入每組血清樣本100 μL ,在37℃恒溫箱里孵育2小時;再清洗反應板,在每個對應的孔中加入標記二抗100 μL ,37℃恒溫箱孵育30分鐘;清洗反應板,依次加入顯色液A和顯色液B各50 μL,用避光板蓋住15分鐘;添加終止液50 μL ,放入酶標儀(EXL808,美國)中讀數(shù),讀取數(shù)值選擇 450 nm OD 值;將 OD 值設為縱坐標,標準品設為橫坐標,將上述數(shù)據(jù)制作出標準曲線圖,再通過曲線得出的方程求出各組樣品相對應的濃度含量。

1.6.4 蘇木精—伊紅染色 將處死的大鼠心臟取出,用多聚甲醛將心臟組織固定,在流水中快速沖洗1小時,將組織用濾紙浸干,依次放置于濃度為 70%、80%、90%、100%的乙醇后用濾紙搽干,再放置于二甲苯中浸泡20分鐘,放置蠟中固定3 小時,應用包埋機包埋操作,將蠟塊用切片機切成厚度為4～6 μm的薄片,放置于 37℃烤箱機中過夜,次日浸泡于二甲苯中,使之脫蠟操作,反復操作2次,放置于濃度遞減的酒精中進行脫水操作。采用蘇木素、酸化水反蘭與伊紅染色,時間分別為5 分鐘、1 分鐘、1分鐘。分別浸 80%、90%、95%、100%酒精1分鐘、二甲苯5 分鐘為宜,樹膠封片后用光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 蛋白質印跡法(Western Blot)法檢測SERCA2a、PLB 蛋白的表達 取出心肌組織,為保持蛋白活性在冰上操作,將心臟組織剪碎勻漿,經(jīng)過離心機離心,取上清液提取蛋白,按照蛋白濃度測定說明書操作,計算各組蛋白濃度,蛋白變形后分裝保存;安裝好電泳儀進行電泳跑膠、蛋白轉膜到PVDF膜?？贵w稀釋劑稀釋抗體(SERCAa、PLB)倒入存有PVDF膜的孵育盒中,置于冰箱4℃恒溫層內孵育過夜;第二日孵育盒中液體更換成TBST,搖床清洗5分鐘×4次,再將存有PVDF膜更換成二抗稀釋液,孵育2小時;運用發(fā)光型凝膠成像儀器,選擇不同曝光模式成像,挑選出最佳圖像,將各組圖像用Photoshop軟件合成對比圖,應用Image J 1.8.0軟件計算灰度值。

1.7統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1觀察大鼠一般情況

空白組的大鼠毛色明亮有光澤,動作反應敏捷迅速,精力狀況較好,食欲食量正常,體型、體質量無明顯變化。無咳嗽氣喘、哮鳴音;模型組的大鼠精力不佳,聚團不喜活動,毛色無光澤,食欲降低飲食減少,體型變瘦,體質量減少,部分出現(xiàn)喘促,甚至有哮鳴音的癥狀;而卡托普利組、補腎活血復方組的大鼠表現(xiàn)正常的活動狀態(tài),毛色由稀疏晦暗逐漸恢復旺盛油亮,精神狀態(tài)轉佳,飼料食用量較前增加,食欲改善,體質量較前均有所增加,沒有出現(xiàn)咳喘表現(xiàn)。

2.2大鼠心臟彩超檢測結果對比

與空白組相比,模型組大鼠LVIDD、LVIDS指標明顯增高,而LVEF和FS、HT都顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,卡托普利組、補腎活血復方組大鼠LVIDD、LVIDS指標明顯降低,LVEF、FS、HR顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與卡托普利組比較,補腎活血復方組大鼠 LVIDD、LVIDS、LVEF、FS、HR指標差異比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟彩超檢測結果對比

2.3大鼠血清NT-ProBNP結果

與空白組相比,模型組血清NT-ProBNP濃度含量顯著提升,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,卡托普利組、補腎活血復方組血清NT-ProBNP濃度含量降低(P<0.01)。補腎活血復方組與卡托普利組之間指標差異比較無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05),具體見表2。

表2 各組大鼠血清NT-ProBNP表達水平比較

2.4觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學情況

空白組大鼠心肌細胞排列有秩序,形態(tài)整齊致密,無心肌組織斷裂,無間質水腫;模型組大鼠表現(xiàn)出心肌細胞形態(tài)學排列無序、心肌走行凌亂無規(guī)律,心肌纖維斷裂破壞,細胞間隙增寬,間質水腫,有少量炎癥細胞浸潤;與補腎活血復方組、卡托普利組大鼠相比較心肌細胞病變明顯減輕,趨于正常,具體見圖1。

注:A空白組; B 模型組;C 補腎活血復方組;D 卡托普利組。

2.5大鼠心肌細胞SERCA2a、PLB蛋白結果

SERCA2a誘導心肌細胞正常收縮—舒張、正常細胞環(huán)境的關鍵條件是維持Ca2+穩(wěn)態(tài),而PLB為SERCA2a上游靶點,負責調控SERCA2a對Ca2+的攝取及釋放。許多研究已驗證心肌細胞缺血、缺氧或其他毒性影響時,會導致心肌內質網(wǎng)調節(jié)Ca2+功能障礙。Western Blot檢測四組大鼠心肌組織中內質網(wǎng)應激相關蛋白SERCA2a、受磷蛋白PLB的表達水平驗證評價補腎活血復方對CHF大鼠心肌組織內質網(wǎng)應激、Ca2+穩(wěn)態(tài)反應的影響,結果由圖2所見。

注: A空白組;B 模型組;C 卡托普利組;D 補腎活血復方組。

與空白組相比,模型組的SERCA2a灰度值明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,空白組、補腎活血復方組、卡托普利組灰度值明顯升高(P<0.01)。補腎活血復方組、卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組相比,模型組的PLB灰度值明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,補腎活血復方組、卡托普利組表達明顯降低(P<0.01)。補腎活血復方組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、表4。

表3 各組大鼠SERCA2a蛋白灰度值比較

表4 各組大鼠PLB蛋白灰度值比較

4 討論

近年研究發(fā)現(xiàn),心血管疾病發(fā)展與內質網(wǎng)應激高度相關,包括動脈粥樣硬化、心肌缺血、心力衰竭等。心臟是通過收縮舒張使血液循環(huán)滿足機體代謝需求。影響心臟收縮舒張最主要的因素是心肌細胞的興奮,誘導心肌收縮—舒張的過程中最主要的因素為Ca2+,Ca2+是維持心肌細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素,SERCA2a在心肌細胞中的含量遠高于其他組織。在心肌收縮時內質網(wǎng)釋放的Ca2+占比90%,心肌舒張時內質網(wǎng)攝取的Ca2+占比75%。因此,SERCA2a在心臟收縮—舒張耦聯(lián)過程中起到關鍵的作用[19]。PLB抑制SERCA2a發(fā)揮作用,也是β腎上腺素能瀑布鏈的主要組成部分[20],β腎上腺素能刺激活化PKA,CaMKII磷酸化PLB,調控減少存在于心肌細胞中的Ca2+濃度,舒緩心肌,也會增加Ca2+濃度,使得心肌收縮[21]。

內質網(wǎng)氧化應激與心血管疾病的發(fā)展關系密切,公認為治療心血管疾病的新靶點,心衰的內質網(wǎng)形態(tài)變化也反映出心衰的病理機制與內質網(wǎng)息息相關[22]。內質網(wǎng)應激是細胞內自由基產生與代謝平衡失調所導致,這一過程中免疫熒光氧化應激產物ROS堆積代謝失衡導致氧化損傷。Ca2+在內質網(wǎng)的病理生理過程中起到了關鍵的作用,當Ca2+耗竭時便會促使內質網(wǎng)氧化應激的產生[23]。因此,調控SERCA2a釋放——攝取Ca2+穩(wěn)態(tài),為改善心肌損失,有效阻斷慢性心力衰竭疾病發(fā)展的研究方向。

現(xiàn)CHF患者多有心悸、胸悶以及氣短甚至不能平臥以及小便次數(shù)短少或累積下肢浮腫等,且常伴有抑郁、失眠等其他精神心理方面的疾病癥狀[24]。中醫(yī)學理論一致肯定,腎乃人體的先天之本,生命之源的居所。若腎精虧虛,無法上行滋養(yǎng)心氣心血,心氣心血虧虛,推動血脈無力,日久閉阻心脈,心臟功能失司,會導致心肌缺血、冠脈綜合征等,呈現(xiàn)心悸胸痛的癥狀;腎主水不利,加重體液潴留,阻礙津液運行而水溢于肌膚,膀胱排尿無力造成少尿的癥狀[25]。所以,CHF病位雖在心,病因卻與腎關系密切。腎精虧虛,心血失源,無法生血,故心血虧損,心脈失養(yǎng)。補腎活血復方治療CHF臨床效果顯著,補腎活血復方有補腎益精、益氣活血的功效。方中成分黃精、菟絲子補腎益精,丹參、紅花、益母草、三七活血祛瘀,人參、黃芪益氣健脾,利水消腫[26]。標本同治能明顯改善CHF癥狀,恢復心臟正常生理功能。本實驗建立CHF大鼠模型成功后,給予補腎活血復方干預,發(fā)現(xiàn)大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)神色以及心臟彩超結果均有改善,且效果與卡托普利相當[27-28]。本研究利用Western Blot檢測大鼠心肌組織中SERCA2a、PLB含量,與空白組相比,模型組的SERCA2a含量明顯降低。與模型組相比,補腎活血復方組、卡托普利組表達明顯升高(P<0.01)。補腎活血、卡托普利兩組結果相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與空白組相比,模型組的PLB含量明顯升高。與模型組相比,補腎活血復方組、卡托普利組表達明顯降低(P<0.01)。補腎活血復方組、卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此看出補腎活血復方可以有效阻止心肌內質網(wǎng)應激反應,協(xié)調心肌細胞中Ca2+平衡穩(wěn)態(tài),恢復CHF大鼠顯著抑制CHF大鼠心肌組織中的內質網(wǎng)應激反應[29]。

綜上所述,補腎活血復方可以有效改善CHF大鼠心肌內質網(wǎng)應激現(xiàn)象,其具體機制可能與通過上調SERCA2a,下調PLB表達,抑制大鼠內質網(wǎng)應激反應,調控心肌細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)環(huán)境有關。