線上銷售藥用豬苓的品質(zhì)評(píng)價(jià)*

楊超勍，歐陽(yáng)建萍，2，邵 君，許春明，孫啟彪，2，季曉紅，2，何 剛，2**

（1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332005；2.九江市真菌資源保育及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332005）

豬苓多孔菌[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]又稱傘形多孔菌，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）多孔菌屬（Polyporus），主要分布于河北、陜西、四川、云南、吉林、安徽等地，是一種名貴的藥用真菌[1]。豬苓多孔菌的干燥菌核（即豬苓菌核）亦稱為豬苓、豬屎苓、野豬苓等，是其入藥部位，具有利水滲濕之功效，主治小便不利、水腫、淋濁、泄瀉、帶下等癥[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，豬苓化學(xué)成分豐富，生物活性多樣，具有利尿、護(hù)腎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4-5]。隨著豬苓藥用價(jià)值逐漸受到人們重視，市場(chǎng)對(duì)豬苓藥材的需求也越來越旺盛。然而，市面所售豬苓質(zhì)量參差不齊，普通百姓缺乏專業(yè)知識(shí)難以辨別真?zhèn)?、評(píng)判品質(zhì)，存在以次充好甚至以假冒真等現(xiàn)象，危害人民群眾用藥安全。

為了解線上平臺(tái)所售豬苓品質(zhì)現(xiàn)狀，通過分子鑒定并對(duì)7 批線上平臺(tái)所售豬苓藥材的性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、總灰分、酸不溶性灰分和主要成分含量進(jìn)行分析。旨在為豬苓藥材真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為合理利用豬苓資源、促進(jìn)豬苓線上市場(chǎng)健康有序發(fā)展提供參考。

1 試驗(yàn)器材

1.1 儀器

UltiMate 3000RSLC 超高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；BX53 生物顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；BioRad C1000 Touch 梯度PCR 儀，美國(guó)伯樂公司；YTH-2.5-10 定時(shí)箱式電阻爐，紹興市蘇珀儀器有限公司；AUW120D 分析天平，日本島津公司；KQ-500TDV 型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XT-500a 多功能粉碎機(jī)，永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.2 試劑

麥角甾醇對(duì)照品（純度≥98%），成都普思生物科技股份有限公司；甲醇為色譜純；石油醚（60～90 ℃，純度99%）、乙酸乙酯、香草醛、濃鹽酸、濃硝酸、濃硫酸等試劑均為分析純；水為超純水；真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 材料

試驗(yàn)所用7 批豬苓藥材樣品均購(gòu)自線上銷售平臺(tái)，并進(jìn)行樣品鑒定。

2 試驗(yàn)方法

2.1 豬苓的性狀和鑒別

參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版一部）》[3]中豬苓藥材性狀與鑒別項(xiàng)下的要求和方法，對(duì)其進(jìn)行外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)和薄層色譜檢測(cè)。

2.2 豬苓分子鑒定

采用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，按照說明書提取樣品DNA。選用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行擴(kuò)增，獲取豬苓樣品ITS 區(qū)基因片段[6]。PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

利用Chromas 軟件仔細(xì)核對(duì)所測(cè)序列峰圖與堿基序列，并在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對(duì)，以確保所得豬苓序列的準(zhǔn)確性。為比較與文獻(xiàn)報(bào)道的豬苓異同，參考ZHOU 等[7]的研究，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載相關(guān)內(nèi)群和外群序列。運(yùn)用MEGA 軟件將本研究中測(cè)得的序列和下載的序列構(gòu)建序列矩陣，使用MUSCLE 3.8.31 軟件對(duì)序列矩陣進(jìn)行比對(duì)分析，借助Gblocks v.0.91b 軟件刪去比對(duì)不理想?yún)^(qū)域或高變區(qū)[8]。比對(duì)后的序列矩陣基于Akaike Information Criterion 標(biāo)準(zhǔn)，采用MrModeltest 2.0 軟件進(jìn)行最適模型選擇，基于最大似然法ML（maximum likelihood，ML）利用RAxML 7.2.8 軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。根據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系判定市售豬苓樣品的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分

參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版 一部）》[3]中豬苓檢查項(xiàng)下要求和方法，對(duì)其水分、總灰分和酸不溶性灰分進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 麥角甾醇含量測(cè)定

參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版 一部）》[3]中豬苓檢查項(xiàng)下要求和《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版四部）》中通則0512 項(xiàng)下的高效液相色譜法[9]，測(cè)定豬苓樣品麥角甾醇含量。

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

規(guī)格為250 mm×4.6 mm、5 μm 的Symmetry C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按麥角甾醇峰計(jì)算不低于5 000[3]。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

取麥角甾醇對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇，制成的麥角甾醇溶液質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.5 g 過四號(hào)篩，精密稱定，置于具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲（功率為220 W，頻率為50 kHz）處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取濾液即得。

2.4.4 測(cè)定方法

分別精密吸取20 μL 的對(duì)照品溶液與各供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬苓分子鑒定

以購(gòu)得的豬苓樣品基因組DNA 為模板，利用真菌rDNA-ITS 區(qū)通用引物ITS1 和ITS4 擴(kuò)增得到603～644 bp 大小的ITS 序列。所得序列提交至GenBank獲得登錄號(hào)，并在NCBI 中進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示與多孔菌屬（Polyporus）真菌具有高度同源性，故7 批豬苓樣品歸屬于多孔菌屬。7 批樣品信息詳見表1。

表1 線上銷售的樣品信息Tab.1 Information of online commercial samples

結(jié)合表1 中各樣品GenBank 登錄信息，采用最大似然法將本研究樣品測(cè)得的ITS 序列與其構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，詳見圖1。

圖1 基于ITS 序列借助最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree inferred from ITS sequences using the maximum likelihood method

如圖1世紀(jì)，樣品1 號(hào)與KY389212 相似性較高，聚為一支；樣品2 號(hào)至7 號(hào)與KY389217、KY389219、HQ225481、EU442270、AY322495 等系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更緊密且聚為一支。根據(jù)7 批樣品分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)一步確認(rèn)7 批樣品均為豬苓Polyporus umbellatus。

3.2 豬苓性狀

豬苓樣品的宏觀特征、切片特征、粉末性狀詳見圖2～4。

圖2 部分線上銷售豬苓的宏觀特征Fig.2 Macroscopic characteristics of some online commercial Polyporus umbellatus

圖3 線上銷售豬苓1 號(hào)～7 號(hào)的切面Fig.3 Section of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

圖4 線上銷售豬苓1 號(hào)～7 號(hào)的粉末Fig.4 Powder of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

如圖2～4世紀(jì)，豬苓原藥材呈不規(guī)則條形、類圓形或扁塊狀，少量樣品有分枝，長(zhǎng)5～15 cm，直徑2～5 cm。表面黑色、灰黑色或棕黑色，皺縮或有瘤狀突起。豬苓體輕，質(zhì)硬，斷面呈白色或黃白色，略呈顆粒狀。氣微，味淡。豬苓粉末呈米白色或黃白色。

3.3 豬苓粉末顯微特征

顯微觀察（40×）下豬苓粉末的特征詳見圖5。

圖5 線上銷售豬苓粉末的顯微特征圖Fig.5 Microscopic characteristics from online commercial Polyporus umbellatus powder

如圖5世紀(jì)，豬苓粉末少數(shù)菌絲呈棕色、不易分離；多數(shù)菌絲無(wú)色，直徑為3～8 μm，彎曲，有橫隔膜，分枝或呈結(jié)節(jié)狀膨大。有草酸鈣方晶，以正方八面體形、規(guī)則的雙錐八面體形為主，直徑為12～56 μm，有時(shí)數(shù)個(gè)結(jié)晶集合。

3.4 薄層鑒別

線上銷售豬苓樣品1 號(hào)～7 號(hào)薄層色譜圖結(jié)果見圖6。

如圖6世紀(jì)，在可見光下檢視，供試品色譜均在與對(duì)照品麥角甾醇色譜相應(yīng)的位置上，7 個(gè)供試樣品均在相同位置顯示相同顏色斑點(diǎn)。

3.5 水分、總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定

測(cè)定市售豬苓原藥材的水分、總灰分、酸不溶灰分，每批樣品3 次重復(fù)，結(jié)果詳見表2。

表2 線上銷售豬苓中水分、總灰分、酸不溶灰分的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of moisture,total ash and acidinsoluble ash in online commercial Polyporus umbellatus

由表2 可知，7 批豬苓原藥材水分含量除2 號(hào)（15.0%）和3 號(hào)（14.1%）超過規(guī)定范圍外，其余樣品均為11.1%～13.4%，符合藥典規(guī)定值（水分≤14.0%）；總灰分含量為2.7%～7.1%，均符合藥典規(guī)定值（總灰分≤12.0%）；酸不溶性灰分含量為0.3%～1.8%，均符合藥典規(guī)定值（酸不溶性灰分≤5.0%）。

3.6 麥角甾醇含量測(cè)定

麥角甾醇含量測(cè)定按照色譜條件進(jìn)樣，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖7；測(cè)定試驗(yàn)重復(fù)3 次，市售豬苓原藥材麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果詳見表3。

圖7 市售豬苓供試品溶液與麥角甾醇對(duì)照品的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of ergosterol standard and test solutions of online commercial Polyporus umbellatus

表3 線上銷售豬苓中麥角甾醇的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of ergosterol in online commercial Polyporus umbellatus

由圖7 和表3 可知，麥角甾醇對(duì)照品約6 min出峰，重現(xiàn)性好，分離度高，峰型尖銳且無(wú)拖尾；7 批豬苓樣品中麥角甾醇的含量為0.228 7%～0.346 9%，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)（麥角甾醇≥0.070%）。

4 結(jié)論與討論

藥用真菌類中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)主要目的在于鑒別藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣，保障人民群眾臨床用藥安全有效。隨著豬苓藥用范圍、來源和市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，關(guān)于豬苓質(zhì)量評(píng)價(jià)亦愈發(fā)受人們關(guān)注。針對(duì)豬苓藥材質(zhì)量控制，《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版 一部）》[3]限定了豬苓藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分和麥角甾醇的含量與性狀特征。然而，豬苓藥材間宏觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)（粉末）近似，傳統(tǒng)性狀鑒別方法不僅需要專業(yè)經(jīng)驗(yàn)且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還不能保證精確無(wú)誤。因此，僅通過外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)和有關(guān)含量分析并不能精準(zhǔn)反映豬苓藥材真?zhèn)?，難以達(dá)到有效質(zhì)量控制的目的。

為此，本研究中綜合利用性狀鑒別、分子鑒定、含量測(cè)定等方法，對(duì)7 批線上平臺(tái)市售豬苓藥材開展性狀、顯微特征、薄層色譜、麥角甾醇含量、水分、總灰分、酸不溶性灰分等評(píng)價(jià)。通過形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行性狀鑒別，結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)和真菌DNA 條形碼技術(shù)，選取rDNA-ITS 基因片段對(duì)市售豬苓藥材開展分子鑒定，明確了7 批藥材的分類地位，確定均為豬苓。綜合形態(tài)學(xué)和分子鑒定進(jìn)行藥材真?zhèn)舞b別，具有快速、準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，可為此類藥材真?zhèn)舞b別提供科學(xué)依據(jù)。

結(jié)果顯示，7 批豬苓藥材水分含量為11.1%～15.0%，除2 號(hào)（安徽霍山）和3 號(hào)（四川阿壩）水分超標(biāo)外，其他批號(hào)符合《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版 一部）》[3]水分項(xiàng)下規(guī)定；而超出水分含量范圍的樣品可能發(fā)生霉變等變質(zhì)現(xiàn)象從而影響質(zhì)量。7 批豬苓總灰分含量為2.7%～7.1%，酸不溶性灰分含量為0.3%～1.8%，說明其灰分檢測(cè)結(jié)果符合要求，藥材純度好。參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版 四部）》[9]豬苓項(xiàng)下含量測(cè)定要求，7 批豬苓麥角甾醇含量為0.228 7%～0.346 9%，其中以產(chǎn)自陜西省佛坪縣的豬苓藥材含量最高；從含量測(cè)定結(jié)果看7 批市售豬苓質(zhì)量符合藥典規(guī)定。

綜上，7 批豬苓藥材中除少部分樣品水分含量超標(biāo)，其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。建議綜合豬苓藥材性狀要求、分子鑒定、品質(zhì)指標(biāo)和含量要求進(jìn)行豬苓質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，以實(shí)現(xiàn)藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)。