山柰根莖化學(xué)成分的研究

喬 蕊 劉俊豪 皮慧芳 李 娟 杜 光*

1.泗水縣人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 273200；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與資源評(píng)價(jià)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430030

山柰(kaempferiagalangaL.)又名沙姜、土麝香等，味辛甘，性溫，無(wú)毒。隸屬姜科(Zingiberaceae)山柰屬(Kaempferia)，是一種多年生宿根草本植物，主要分布于廣東、海南、廣西、云南、四川、臺(tái)灣、福建等省區(qū)[1]。具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗蟲(chóng)、抗血管生成等作用，在民間常用于治療胃脘寒痛、消化不良、急性胃腸炎、跌打損傷等病癥，在《本草從新》等均有記載[2-3]。近年來(lái)，從山柰屬植物中分離和鑒定出了許多苯丙素類、二萜類和多氧環(huán)已烷衍生物[4-8]。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用民族藥用資源，本研究對(duì)山柰根莖的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了15個(gè)化合物，且6個(gè)化合物首次從該植物中分離得到。

1 材料與儀器

高效液相色譜儀LC100(上海伍豐科技有限公司)；RI-201H示差折光檢測(cè)器(日本昭和電工株式會(huì)社)；MODEL 1706 UV/VIS紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；液相色譜柱為YMC·GEL ODS-A-HG (250×10 mm, 5 μm; YMC Co, Ltd, Kyoto, Japan)；核磁共振儀德國(guó)布魯克公司(Bruker AM-400和Bruker AM-600)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(美國(guó)Healthcar公司)；硅膠柱層析填料(100-200目/200-300目，青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；超高效薄層色譜硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)；液相所用試劑為色譜純甲醇和乙腈(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

山柰根莖于2015年3月購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，由湖北省武漢市九州通醫(yī)藥公司的蔡尚軍主任藥師鑒定為姜科山柰屬植物山柰(KaempferiagalangaL.)的根莖。藥材樣品保存于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院1號(hào)樓天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離 山柰根莖50 kg，粉碎，用 150 L 的95%乙醇分四次冷浸，每次48 h，濃縮至2000 mL，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇得到總浸膏，將總浸膏分散于適量水中后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位847 g,乙酸乙酯部位402 g，正丁醇部位885 g。

石油醚部位以PE-EtOAc為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠柱層析梯度洗脫，每100 mL為一個(gè)餾分進(jìn)行采集，經(jīng)薄層檢測(cè)，合并成分相似的組分，得到20個(gè)部分(Fr.1～Fr.20)。Fr.5經(jīng)Sephadex LH20，以甲醇為流動(dòng)相等度洗脫，又經(jīng)硅膠柱，以PE-DCM梯度洗脫，結(jié)合HPLC，得化合物3(5 mg)、6(3 mg)。

乙酸乙酯部位先以PE-EtOAc為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠柱層析梯度洗脫，后換為EtOAc-MeOH梯度洗脫，經(jīng)薄層檢識(shí)合并成分相似的流分，共得到23個(gè)部分(Fr.1～Fr.23)。Fr.7上ODS柱，MeOH梯度洗脫，結(jié)合HPLC，得化合物2(7 mg)、9(4 mg)、10(5 mg)、11(8 mg)；Fr.8上MCI柱，MeOH-H2O梯度洗脫，并用HPLC進(jìn)一步純化，得到化合物1(9 mg)、4(3 mg)；Fr.9析出固體，抽濾與母液分離，甲醇溶解固體后用HPLC純化，得化合物8(10 mg)、5(6 mg)；Fr.10依次用ODS柱(MeOH-H2O梯度洗脫)和Sephadex LH20(MeOH等度洗脫)進(jìn)行分離，并用HPLC進(jìn)一步純化，得化合物7(5 mg)、12(8 mg)、14(2 mg)、15(2 mg)；Fr.11上ODS柱，MeOH-H2O梯度洗脫，重結(jié)晶得化合物13(5 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1 無(wú)色針狀晶體,1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.94 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.94 (2H, d,J=8.7 Hz, H-3, 5)、3.83 (3H, s, OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物1為對(duì)甲氧基苯甲酸。

2.2.2 化合物2 無(wú)色晶體,1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.83 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6)、6.77 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物2為對(duì)羥基苯甲酸。

2.2.3 化合物3 微黃色液體，有芳香味，1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.55(2H, m, H-2, 6)、7.37(3H, m, H-3, 4, 5 )、7.65(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.48(1H, d,J=16.0 Hz, H-8)、4.21(2H, q,J=7.1 Hz, H-1′)、 1.30(3H, t,J=7.1 Hz, H-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物3為反式肉桂酸乙酯。

2.2.4 化合物4 白色晶體，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.52 (2H, d,J=8.7 Hz,H-2,6)、6.93(2H, d,J=8.8 Hz, H-3, 5)、7.60(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.34(1H, d,J=16.0 Hz, H-8)、3.80(3H, s, OCH3)、4.20 (2H, q,J=7.1 Hz, H-1′)、1.29(3H, t,J=7.1 Hz, H-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物4為反式對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2.5 化合物5 白色晶體，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.50(2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.91 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3, 5)、7.58 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7)、6.29 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8)、3.79 (3H, s, OCH3)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.7 (C-9)、162.9 (C-4)、146.0 (C-7)、130.7 (C-2, 6)、128.2 (C-1)、116.4(C-8)、115.2 (C-3, 5)、55.7 (OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物5為反式對(duì)甲氧基肉桂酸。

2.2.6 化合物6 微黃色液體，1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ：7.68 (2H, d,J=6.8 Hz, H-2, 6)、6.88 (2H，d，J=6.8 Hz, H-3, 5)、6.85 (1H，d，J=12.8 Hz, H-7)、5.80 (1H, d,J=12.8 Hz, H-8)、3.78 (3H, s, 4-OCH3)、4.16 (2H, q,J= 7.1 Hz, H-′)、1.25 (3H, t,J= 7.1 Hz, H-2′)。參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道，鑒定化合物6為順式對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2.7 化合物7 淡黃色粉末，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.18 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2)、7.06 (1H, d,J=8.2, 1.8 Hz, H-6)、6.81 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5)、7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7)、6.32 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8)、3.89 (3H, s,OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物7為阿魏酸。

2.2.8 化合物8 無(wú)色針狀晶體。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：δ7.94 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.94 (2H, d,J=8.7 Hz, H-3, 5)、3.83 (3H, s, OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物8為對(duì)甲氧基苯甲酸。

2.2.9 化合物9 無(wú)色油狀物，有芳香味，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.73(2H, m, H-3, 6)、7.62(2H, m, H-4, 5)、4.26(4H, t,J= 6.5 Hz, H-8, H-8′)、1.73 (4H, m, H-9, 9′)、1.46 (4H, m, H-10, 10′)、0.98 (6H, t,J=7.4 Hz, H-11, 11′)。13C-NMR (100 MHz)δ：169.3 (C-7, 7′)、133.6 (C-1, 2)、132.3 (C-4, 5)、129.9 (C-3, 6)、66.7 (C-8, 8′)、31.7 (C-9, 9′)、20.3 (C-10,10′)、14.0 (C-11, 11′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物9為鄰苯二甲酸二丁酯。

2.2.10 化合物10 無(wú)色液體，1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ：5.35 (2H, m, H-5, 6)、0.88 (3H, m, H-10)、1.27 (4H, m, H-3, 8, 9)、1.58 (2H, m, H-7)、2.05 (2H, m, H-4)、2.26 (2H, m, H-2)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ：176.5 (C-1)、129.1 (C-6)、127.0 (C-5)、33.4 (C-2)、38.8 (C-7)、31.5 (C-8)、26.6 (C-4)、24.6 (C-3)、22.2 (C-9)、12.9 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物10鑒定為5-癸烯酸。

2.2.11 化合物11 白色固體，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ： 2.35 (2H, t,J=7.5 Hz, H-2)、1.63 (2H, m, H-3)、1.25 (28H, m)、0.88 (3H, t,J= 6.8 Hz)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物11為硬脂酸。

2.2.12 化合物12 白色固體，1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ：4.22 (1H, dd,J= 11.7, 4.6 Hz, H-1a)、4.16 (1H, dd,J= 11.6, 6.1 Hz, H-1b)、3.99-3.90 (1H, m, H-2)、3.71 (1H, dd,J=11.5, 3.9 Hz, H-3a)、3.61 (1H, dd,J=11.5, 5.8 Hz, H-3b)、2.36 (2H, t,J= 7.6 Hz, H-2′)、1.67-1.59 (2H, m, H-15)、1.39-1.21 (24H, m)、0.89 (3H, t,J= 6.8 Hz, H-16′)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物12為單棕櫚酸甘油酯。

2.2.13 化合物13 白色晶體，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：3.73 (1H，s, OH)、3.66 (9H, s, OCH3)、2.94 (2H, d,J=15.5 Hz, H-2)、2.82(2H, d,J=15.5 Hz, H-4)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：176.6 (C-6)、 172.1(C-1, 5)、74.4 (C-3)、53.4 (C-7, 9)、44.2 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物13為檸檬酸三甲酯。

2.2.14 化合物14 黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：12.47 (1H, s, 5-OH)、10.77 (1H, s, 7-OH)、10.09 (1H, s, 4′-OH)、9.37 (1H, s, 3-OH)、8.03 (2H, d,J=9.0 Hz, H-2′,6′)、6.92 (2H, d,J=9.0 Hz, H-3′, 5′)、6.18 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6)、6.43 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物14為山柰酚。

2.2.15 化合物15 黃色粉末，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：12.96 (1H, s, 5-OH)、10.80 (1H, s, 7-OH)、9.89 (1H, s, 4′-OH)、9.41 (1H, s, 3′-OH)、7.41 (1H, d,J=2.3 Hz, H-6′)、7.39 (1H, dd,J= 8.3, 2.3 Hz, H-2′)、6.89 (1H, d,J=8.3 Hz, H-5′)、6.43 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8)、6.18 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物15為木犀草素。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從山柰中共提取分離得到15個(gè)化合物，包括芳香烴類、脂肪酸類、肉桂酸類及黃酮類等。其中，對(duì)甲氧基苯甲酸(1)、阿魏酸(7)、鄰苯二甲酸二丁酯(9)、5-癸烯酸(10)、單棕櫚酸甘油(12)、檸檬酸三甲酯(13) 均為首次從山柰屬植物中分離得到，5-癸烯酸(10) 為首次從該植物中分離得到。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在所鑒定的15個(gè)化合物中，阿魏酸(7)、山柰酚(14)、木犀草素(15) 具有顯著的生物活性，如阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗疲勞、延緩衰老的功效[22]；山奈酚可抑制人結(jié)直腸癌RKO細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)可能通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)RKO細(xì)胞自噬[23]；木犀草素可能通過(guò)抑制蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)通路，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲、遷移能力[24]。這些成分可能是山柰發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗血管生成的物質(zhì)基礎(chǔ)。