一測多評法同時測定丹參藥材中8 種水溶性成分含量*

陳雪琴，賈文江，周仔莉，李 鵬，賈 衛(wèi)，柯 園，王敏珍，張躍進

（1. 陜西省商洛市藥品檢驗所，陜西 商洛 726000； 2. 陜西省商洛市農(nóng)業(yè)科學研究所，陜西 商洛 726000；3. 西北農(nóng)林科技大學，陜西 咸陽 712100）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge. 的干燥根和根莖，是歷版《中國藥典》收錄的大宗常用中藥材之一，現(xiàn)主要以栽培品入藥，主產(chǎn)于陜西（為陜西商洛十大商藥之一）、山東、河南、安徽、四川等地。丹參的藥物活性成分有上百種，其水溶性成分主要包括丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸和迷迭香酸及丹酚酸A，B，F(xiàn)，G 等［1］，有抗凝血、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎等作用，而水溶性成分有抗氧化、降血壓、預防心腦血管疾病等作用，臨床常用于治療冠心病、心絞痛、胸痹心痛等癥［2］。然而，在丹參藥材的品質(zhì)控制及等級劃分中，水溶性指標性成分控制僅針對丹酚酸B 含量做出了相應規(guī)定。使用外標法測定丹參酚酸類成分的含量也存在控制單一、重復性差、操作煩瑣、對照品難購買等問題。故本研究中對丹參中的丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸F、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A等水溶性成分進行了全面研究，對上述8 個成分進行了確認，并采用一測多評（QAMS）法同時測定丹參藥材中8種水溶性成分的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)（含紫外檢測器，沃特世科技＜上海＞有限公司）；Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀（含DAD 檢測器，美國Agilent公司）；Shimadzu LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；BS224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）；SY-800型超聲波清洗機（上海寧商超聲清洗儀器有限公司）；Medium-RS30UVF 型實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；凌生1000C型多功能粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）等。

1.2 試藥

丹酚酸B 對照品（批號為111562-201917，含量為96.6%），丹參素鈉對照品（批號為110855-201915，含量為97.8%），原兒茶醛對照品（批號為110810 -201909，含量為99.6%），咖啡酸對照品（批號為110885-201703，含量為100%），迷迭香酸對照品（批號為111871-202007，含量為98.1%），均購于中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸A 對照品（批號為B20260，含量為98.0%），丹酚酸F 對照品（批號為B25806，含量為98.0%），紫草酸對照品（批號為B21683，含量為98.0%），均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。丹參藥材（來源見表1）經(jīng)陜西省商洛市藥品檢驗所陳雪琴教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）；流速：1.1 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸F、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A 對照品各適量，精密稱定，制成含各成分質(zhì)量濃度分別為55.257，12.848，19.342，24.500，94.176，105.84，75.831，13.524 μg/mL的混合對照品溶液。取藥材樣品粉末（過3 號篩）約0.15 g，精密稱定，置150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，理論板數(shù)按各成分峰計均應大于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Sodium Danshensu 2.Protocatechualdehyde 3.Caffeic acid 4.Salvianolic acid F 5.Rosmarinic acid 6.Lithospermic acid 7.Salvianolic acid B 8.Salvianolic acid AA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液1，5，10，15，20，25 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，μL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果8 個成分峰面積的RSD分別為1.03%，1.21%，0.98%，1.06%，1.37%，0.87%，0.79%，1.08%，均小于1.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別在室溫下放置0，3，6，12，18，24 h 時按2.1 項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果8 個成分峰面積的RSD分別為1.27%，1.04%，1.18%，0.94%，0.84%，1.29%，1.34%，0.79%，均小于1.5%（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（編號S5）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，各6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果8 個成分含量的RSD分別為1.42%，1.00%，1.24%，1.37%，1.49%，0.91%，0.97%，1.32%，均小于1.5%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號S5，含丹參素鈉0.370 mg、原兒茶醛0.160 mg、咖啡酸0.209 mg、丹酚酸F 0.101 mg、迷迭香酸0.719 mg、紫草酸0.510 mg、丹酚酸B 8.609 mg、丹酚酸A 0.039 mg）粉末0.15 g，精密稱定，分別加入相應對照品適量，再按2.2 項下的方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果各待測成分平均加樣回收率分別為98.96%，98.94%，99.20%，99.67%，102.43%，99.74%，101.94%，99.37%，RSD分 別 為0.93%，1.02%，1.41%，1.15%，1.30%，1.23%，1.06%，0.88%，均小于1.5%（n=6）。

2.4 相對校正因子（f）的確定

選取丹酚酸B 為內(nèi)標物，建立丹酚酸B 與其他待測成分（mi，i=1，2，…，7）間的相對校正因子公式為。式中，Ami為某一待測成分的峰面積，Wmi為某一待測成分的質(zhì)量；A丹酚酸B為丹酚酸B 的峰面積，W丹酚酸B為丹酚酸B 的質(zhì)量。

取2.2 項下混合對照品溶液1，5，10，15，20 μL，按2.1 項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，分別計算以丹酚酸B為內(nèi)標時其余7個成分的f值，結(jié)果見表3。可見，7 個成分f值的RSD均小于1.0%（n= 5），符合試驗要求。

表3 各待測成分的相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of each component to be tested

2.5 f 的耐用性試驗

液相色譜儀和色譜柱：取藥材樣品（編號S5）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件，釆用Shimadzu LC-20AT型、Agilent 1260Ⅱ型及Waters e2695 型高效液相色譜系統(tǒng)，分別采用Agilent 5 TC - C18（2）柱、Kromasil 100 - 5 - C18柱，以及Welch Ultimate C18柱（規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm）進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果表明，色譜系統(tǒng)、色譜柱發(fā)生一定變化時本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。詳見表4。

表4 不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effect of different chromatographic systems and chromatographic columns on relative correction factors

柱溫：取藥材樣品（編號S5）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件（分別設(shè)置柱溫為20，25，30，35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表5，各成分f值的RSD均小于1.0%，表明在實驗室條件下柱溫發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effect of different column temperatures on relative correction factors

流速：取藥材樣品（編號S5）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件（分別設(shè)置流速為1.0，1.1，1.2，1.3 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表6，各待測成分f值的RSD均小于1.0%，表明流速發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

表6 不同流速對相對校正因子的影響Tab.6 Effect of different flow rates on relative correction factors

2.6 待測成分色譜峰定位

取2.5項下供試品溶液適量，分別注入不同高效液相色譜系統(tǒng)（同2.5 項下色譜儀、色譜柱），計算各成分的相對保留時間［3］。結(jié)果的RSD均小于1.00%。詳見表7。

表7 各待測成分的相對保留時間Tab.7 Relative retention time of each component to be tested

2.7 QAMS 法與外標法測定結(jié)果比較

取16 批藥材樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別采用外標法與QAMS法計算各成分含量，配對t檢驗結(jié)果表明，2種測定方法的結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），詳見表8和表9。

表8 外標法與QAMS法含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.8 Results of the content determination of seven components determined by external standard method and QAMS method（mg/g）

表9 配對t 檢驗分析結(jié)果Tab.9 results analyzed by paired t test

3 討論

3.1 丹參藥材樣品選擇

有研究表明，炮制方式等外部因素會導致丹參藥材劣變、藥性改變、有效成分損失等問題出現(xiàn)，影響藥材的供應和以其為原料的中成藥的質(zhì)量［4-8］。為消除上述干擾因素，對藥材樣品的選擇尤為重要。故預試驗中以樣品（編號S6）為研究對象，按不同炮制及烘干方式（陰干、曬干、55 ℃烘干、切片陰干、切片曬干、切片55 ℃烘干）處理樣品，結(jié)果丹參藥材中丹酚酸B 含量相比丹參飲片中的高。溫度的升高和光照使丹酚酸B部分損失或轉(zhuǎn)化，從而降低其含量［9-12］。陰干法則很好地避免了諸多不利因素，較好地保持了丹參原藥材的藥性及有效成分，故丹酚酸B 的損失較少。炮制工藝對丹參飲片的質(zhì)量影響很大。生品飲片相對于原藥材，需經(jīng)洗、晾、燜、潤、切等炮制工藝，此過程受物理因素和化學因素的影響，丹酚酸B等水溶性成分的含量流失過多。因此，當?shù)⑷胨帟r，忌沖洗、曝曬，以避免有效成分流失。故本研究中選擇丹參藥材樣品（編號S1 - S16）均以原藥材陰干入藥，以最大限度地保留丹參有效成分，能更客觀全面地反映丹參內(nèi)在品質(zhì)。

3.2 丹參QAMS 法質(zhì)量評價

關(guān)于丹參的檢驗標準方法，2020 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定了丹參酮類成分采用丹參酮ⅡA為參照，以f來計算其他丹參酮類成分的含量。但相對于丹參中豐富的活性成分和廣泛的應用，單一質(zhì)量控制指標不能客觀全面地反映丹參中各水溶性成分的含量差異和變化規(guī)律。隨著近年丹參中的丹酚酸F、丹酚酸G、丹酚酸A等成分被深入研究，其更多潛在應用價值被發(fā)現(xiàn)。這些成分的提取方法和測定方法也倍受重視。本研究中因購買不到丹酚酸G 對照品，僅選擇丹酚酸F、丹酚酸A等主要活性成分為研究對象［13-14］，并采用f計算其他待測成分的含量，較客觀地反映了丹參藥材（尤其是商洛丹參）中酚酸類成分的分布規(guī)律。同時為丹參藥材等級劃分及道地性差異的研究提供了一種切實可行的研究方法。經(jīng)耐用性評價和系統(tǒng)適用性試驗，該方法可行且高效。QAMS 法測定各成分含量與外標法測定結(jié)果無顯著差異，表明該方法準確且科學。不僅可彌補對照品昂貴稀缺的不足，簡化試驗步驟，節(jié)省時間和成本，還可以更加科學全面地評價丹參藥材的品質(zhì)和等級，有助于更好地區(qū)分藥材的道地性差異，為其質(zhì)量控制提供有力的技術(shù)支撐［15-19］。為了更全面地反映丹參藥材的質(zhì)量，今后將對其中的丹酚酸G等成分繼續(xù)展開研究和分析。