超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定當(dāng)歸補(bǔ)血湯中6 種成分含量

胡燕梨，譚麗盈，盧秋桃，賴燕芬

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510400）

近年來，隨著國家對(duì)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)支持力度的逐漸加大，中藥新藥研發(fā)展現(xiàn)出蓬勃生機(jī)，尤其在2021 年，中藥新藥批準(zhǔn)文件達(dá)12個(gè)，創(chuàng)6年來新高，且含3個(gè)按古代經(jīng)典名方加減組方的中藥復(fù)方制劑?？梢姡兴幗?jīng)典名方也是目前中藥新藥研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯的研究多集中在臨床配伍、藥理、臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方面［1-4］，涉及質(zhì)量控制的報(bào)道較少，為此，本研究中參考文獻(xiàn)［5 - 7］，建立了同時(shí)測定當(dāng)歸補(bǔ)血湯中當(dāng)歸和黃芪藥材中阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY H - Class 型超高效液相色譜儀，Xevo TQD 型三重四極桿質(zhì)譜儀，含F(xiàn)TN 全自動(dòng)進(jìn)樣器、QSM四元溶劑管理器（美國Waters 公司）；KQ - 500DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ML204T 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；100 μL、200 μL、1 mL可調(diào)式移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773 - 201915，含量99.4%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為111920-201503，含量98.3%），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-201717，含量96.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（成都曼斯特公司，批號(hào)為Must -17041012，含量99.50%）；芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)為DST190501-011，含量98.9%），毛蕊異黃酮對(duì)照品（批號(hào)為DST200915-012，含量98.0%），均購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；乙腈、甲醇（液質(zhì)聯(lián)用級(jí)）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。黃芪藥材的批號(hào)與產(chǎn)地分別為191201（內(nèi)蒙古），200301（甘肅），200501（陜西），當(dāng)歸藥材的批號(hào)與產(chǎn)地分別為200201（甘肅＜岷縣＞），200601（四川），D200802（云南），兩者分別經(jīng)醫(yī)院梁文能副主任藥師鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels及豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao。將不同批2種藥材分別組方，得9批樣品（表1）。

表1 樣品及藥材批號(hào)Tab.1 Batch numbers of samples and medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)28%A→38%A，10～13 min時(shí)38%A→60%A，13～14 min 時(shí)60%A→28%A，14～16 min 時(shí)28%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）采集；正負(fù)離子模式監(jiān)測掃描（僅阿魏酸為負(fù)離子模式）采集；碰撞氣為氬氣；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；去溶劑氣流量700 L/h；去溶劑氣溫度350 ℃。6種成分質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 各成分的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.2 Mass spectrum parameters of each component

2.2 溶液制備

取阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為50.62，80.34，30.06，60.23，33.65，102.38 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。取當(dāng)歸藥材樣品8 g，黃芪藥材樣品40 g，精密稱定，加8倍量水（約400 mL），浸泡30 min，煎煮40 min，趁熱過濾，定容至200 mL，冷凍保存，作為基準(zhǔn)樣品；取1 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按當(dāng)歸補(bǔ)血湯的處方及工藝，分別制備不含當(dāng)歸和黃芪的單一陰性樣品，冷凍保存，使用時(shí)按供試品溶液制備方法制得2種陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性試驗(yàn)：分別取2.2項(xiàng)下4種溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)按各成分峰計(jì)均應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對(duì)照無干擾，表明方法的專屬性良好。詳見圖1。

圖1 總離子流圖1.Calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside 2.Ferulic acid 3.Calycosin 4.Formononetin 5.Astragaloside Ⅳ 6.LigustilideA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Angelicae Radix D.Negative reference solution lacking Astragali RadixFig.1 Total ion chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，得系列混合對(duì)照品溶液。精密量取2 μL，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）分別為3∶1 和10∶1 時(shí)各待測成分質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限，結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷的檢測限分別為0.155，0.247，0.092，0.185，0.103，0.315 μg/ kg，定 量 限 分 別 為0.518，0.823，0.308，0.617，0.344，1.050 μg/kg。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.32%，3.87%，2.68%，3.52%，1.43%，3.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，室溫下分別于0，1，2，4，8，12，16，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為4.01%，3.52%，2.78%，3.35%，2.69%，4.15%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下基準(zhǔn)樣品1 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷的含量分別為0.705 2，11.325 5，1.722 1，1.538 2，1.240 4，2.128 6 μg/g，RSD分別為2.51%，1.68%，1.27%，2.38%，2.97%，3.18%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量基準(zhǔn)樣品，共6份，分別加入阿魏酸、藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷對(duì)照品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取各批樣品適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，平行3 次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.5 Results of the content determination of six components in the samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 研究背景

2018 年，國家中醫(yī)藥管理局公布了《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，共100首，當(dāng)歸補(bǔ)血湯為第51首，該方源于《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪和當(dāng)歸兩味藥按5∶1（m/m）組方，為益氣補(bǔ)血養(yǎng)陰名方［8］，原方記載：“黃芪一兩，當(dāng)歸二錢（酒洗），上件咀，都作已服，水二盞煎至一盞，去渣，溫服，空心食前。治肌熱，燥熱，困渴引飲，目赤面紅，晝夜不息。其脈洪大而虛，重按全無?！庇捎诠糯挠?jì)量工具及飲片的炮制規(guī)格、劑量及煎煮方式均與現(xiàn)代有差異，故明確處方中的關(guān)鍵信息，對(duì)于開發(fā)當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有重要意義。當(dāng)歸中主要含有機(jī)酸、萜類、揮發(fā)油等［9-11］，其中阿魏酸能抑制血小板聚集［12］，藁本內(nèi)酯有抑制子宮平滑肌收縮等作用［13］；黃芪主要成分為黃芪皂苷類、黃酮及其苷類化合物，此外還有有機(jī)酸和多糖類成分，這些成分均具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和保護(hù)心血管的作用［14-17］。

目前主要有當(dāng)歸補(bǔ)血湯中單一或兩三種成分含量測定、指紋圖譜、化學(xué)成分和微量元素的研究［18-20］，未見多種成分同時(shí)測定方法的報(bào)道，由于古代經(jīng)典名方主要為水提液，傳統(tǒng)的液相色譜在水提液分離方面效果不佳，干擾較大，且黃芪甲苷在紫外吸收中屬末端吸收，測定時(shí)干擾較大，響應(yīng)較低，故與其他成分同時(shí)測定時(shí)只能采用液質(zhì)聯(lián)用法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可采用獨(dú)特的MRM 掃描方式，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和定量分析，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，多用于此類研究。

3.2 指標(biāo)成分選擇

阿魏酸、藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸藥材發(fā)揮藥效的主要活性成分，阿魏酸具有擴(kuò)張血管，抗腫瘤和增強(qiáng)免疫的作用，藁本內(nèi)酯可抑制子宮平滑肌收縮，芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷是黃芪藥材中的主要黃酮及其苷類化合物，是其質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。芒柄花素具有改善動(dòng)脈粥樣硬化病變，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮同時(shí)具有清除氧自由基/抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，黃芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗氧化和保護(hù)心腦血管的藥理作用，其作用均與當(dāng)歸補(bǔ)血湯的藥理作用密切相關(guān)。由于中藥發(fā)揮作用是多靶點(diǎn)多作用機(jī)制的綜合表現(xiàn)，因此同時(shí)測定當(dāng)歸補(bǔ)血湯中多種成分含量更利于對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制和全面評(píng)價(jià)。

3.3 試驗(yàn)條件選擇

組分成分測定中常采用梯度洗脫進(jìn)行分離。預(yù)試驗(yàn)中考察流動(dòng)相時(shí)首先分有機(jī)相（甲醇和乙腈）與水相（0.1%甲酸溶液和0.1%乙酸銨溶液）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)0.1%乙酸銨溶液- 甲醇（或乙腈）在正離子模式采集下阿魏酸、芒柄花素的色譜峰形拖尾，當(dāng)采用甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸水溶液時(shí)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中6個(gè)成分的色譜峰均可良好分離，乙腈-0.1%甲酸水溶液出峰時(shí)間較短，且響應(yīng)值較高，故以此為流動(dòng)相。色譜柱分別考察了Agilent SB C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），Waters BEH C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）和Shimadzu Shim - pack GIST C18AQ HP 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），結(jié)果各成分色譜峰均分離良好，可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量，表明該方法的耐用性良好。其后根據(jù)6 個(gè)成分的前體離子在正（或負(fù)）離子模式下確定毛細(xì)管和錐孔的電壓，脫溶劑氣的流速及溫度，再優(yōu)化碰撞能量，通過調(diào)整碰撞電壓，共優(yōu)化2個(gè)子離子，選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高、穩(wěn)定性好的離子作為定量離子，另一個(gè)作為定性離子，可保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4 結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，9 批樣品中6 種成分的含量波動(dòng)范圍均符合《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》要求的均值±30%之間。但本試驗(yàn)中所測樣品均為實(shí)驗(yàn)室小試樣品，且所制備樣品批數(shù)較少，黃芪和當(dāng)歸藥材的產(chǎn)地及信息偏少，樣品為隨機(jī)組方制備，測定值不能全面反映2種藥材的質(zhì)量信息。對(duì)于經(jīng)典名方的研究至少應(yīng)包含道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)的藥材，本研究中在選擇時(shí)也遵循了上述原則，采用了甘肅當(dāng)歸和內(nèi)蒙古黃芪進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用不同產(chǎn)地黃芪、當(dāng)歸組方制備時(shí)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中6 種成分的含量具有一定差異，因此，樣品制備中應(yīng)考慮藥材的產(chǎn)地信息，進(jìn)行多批次多產(chǎn)地藥材的收集，從而保證樣本的代表性，同時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床藥效結(jié)果，優(yōu)選最佳藥材產(chǎn)地組方，從而保證當(dāng)歸補(bǔ)血湯的質(zhì)量可控，為制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

3.5 小結(jié)

在古代經(jīng)典名方的開發(fā)研究中，一定要在遵循古代的制法基礎(chǔ)上用歷史和創(chuàng)新的思維對(duì)其劑量、炮制、基源等進(jìn)行考證。本研究中所建UPLC - MS/ MS 法操作簡單，專屬性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均符合要求。相比目前報(bào)道的液相色譜法，具有靈敏度更高，分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，并且9批樣品各成分含量基本符合中藥經(jīng)典名方含量波動(dòng)的規(guī)定范圍。然而，經(jīng)典名方及其制劑的開發(fā)要建立全過程（藥材- 飲片- 基準(zhǔn)樣品- 中間體-復(fù)方制劑）質(zhì)量控制體系，應(yīng)適時(shí)建立指紋圖譜（或特征圖譜）并結(jié)合含量測定方法對(duì)其進(jìn)行控制和監(jiān)測，從而保證其質(zhì)量的可控性和穩(wěn)定性，但目前對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基礎(chǔ)成分與作用機(jī)理的研究較少，下一步需進(jìn)行飛行時(shí)間（Q-TOF）或離子阱（Q-Trap）質(zhì)譜及藥理實(shí)驗(yàn)研究，從而為更好地提升當(dāng)歸補(bǔ)血湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其相關(guān)制劑的后續(xù)研究開發(fā)提供依據(jù)。