高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃芪健脾口服液中黃芪甲苷含量*

王 錚，呂益濤，蔣倩倩，滕澤學(xué)，強(qiáng)君麗

（甘肅省白銀市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 白銀 730900）

復(fù)方黃芪健脾口服液由黃芪、萊菔子、白術(shù)、山楂、山藥、桑葉、大棗等藥材組方，有益氣固表、健脾消食功效，對(duì)小兒脾胃虛弱引起的反復(fù)呼吸道感染、營養(yǎng)性貧血、厭食等病癥療效顯著。黃芪甲苷屬皂苷類成分，是制劑中君藥黃芪的主要成分，也是《中國藥典》2020 年版一部中黃芪中藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)［1］，具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化、抗哮喘、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、心肌保護(hù)等多重作用［2-3］，因此選取黃芪甲苷含量作為該口服液的質(zhì)量控制指標(biāo)。該制劑現(xiàn)行地方標(biāo)準(zhǔn)［4］所用薄層色譜法已不能有效滿足其質(zhì)量控制，而《中國藥典》2020年版一部收載含黃芪的中藥成方制劑質(zhì)量控制方法均改為高效液相色譜（HPLC）法。本研究中參考藥典中黃芪含量測(cè)定項(xiàng)下方法及文獻(xiàn)［5-14］，建立了測(cè)定復(fù)方黃芪健脾口服液中黃芪甲苷含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC -ELSD）法，簡化了前處理步驟，縮短了測(cè)定周期，提高了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，可為該制劑的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括CTO-10ASVP柱溫箱、LC-20AT 泵、SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、AA-530空氣壓縮機(jī)、ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光檢測(cè)器、CBM-20A控制器（日本Shimadzu 公司）；PL - FS 80T 型數(shù)控超聲波清洗器（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；XPE -105DU型及EL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度分別為0.01 mg和0.1 mg）；HHS - 4S 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海市南陽儀器有限公司）。

1.2 試藥

復(fù)方黃芪健脾口服液（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)分別為20031，20033，20048）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110781 - 202118，含量96.8%）；大孔吸附樹脂D101（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)為C11417836）；甲醇、乙腈為色譜級(jí)，無水乙醇、氨水為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（34∶66，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度：40 ℃；壓縮空氣壓力：350 kPa。

2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對(duì)照品12.53 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.485 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取樣品20 mL，加氨水20 mL 后搖勻靜置5 min，通過D101 型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為20 cm），分別用氨試液100 mL，水100 mL，40%乙醇100 mL 洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，移至5 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容，即得供試品溶液。按復(fù)方黃芪健脾口服液的處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)為25 870，分離度均大于1.5，基線分離良好；陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Astragaloside ⅣA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加80%甲醇稀釋成每1 mL 中分別含0.048 5，0.121 3，0.242 6，0.363 9，0.485 2 mg 黃芪甲苷系列對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以黃芪甲苷進(jìn)樣量（μg）的對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.585 5X+ 4.264 5（r= 0.999 6，n= 5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.97～9.70 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限考察：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.048 5 mg/mL的對(duì)照品溶液適量，加80%甲醇倍比稀釋，以信噪比（S/N）為10∶1 時(shí)待測(cè)成分質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果黃芪甲苷的定量限為3.64 ng/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為0.56%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別在室溫下放置0，2，4，6，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為1.82%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20031）適量，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果黃芪甲苷含量的平均值為34.50 μg/mL，RSD為1.20%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為20031）10 mL，共9份，分別加入質(zhì)量濃度為0.485 0 mg/mL 的對(duì)照品溶液0.6，0.7，0.8 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各20 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。另取3 批樣品，按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理方法制備，精密量取樣品50 mL，加入水飽和正丁醇30 mL 振搖，提取4 次，合并正丁醇液，加入氨試液40 mL 洗滌2 次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，加水5 mL溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），加水50 mL、40%乙醇30 mL 洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇溶解殘?jiān)筠D(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中，即得供試品溶液［4］，精密吸取4 μL 和8 μL，再取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 μL 和4 μL，交叉點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板，以氯仿-甲醇-水（13∶6∶2，V/V/V）10 ℃以下設(shè)置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，顯色，在530 nm 和700 nm 波長處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液吸光度，計(jì)算黃芪甲苷含量。結(jié)果見表2。可見，HPLC-ELSD 法測(cè)定的結(jié)果精密度更高?，F(xiàn)行含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定黃芪甲苷的含量為不得少于20 μg/ mL，由測(cè)定結(jié)果可知，分析方法的改變對(duì)限度標(biāo)準(zhǔn)無影響。

表2 2種方法測(cè)定黃芪甲苷含量結(jié)果比較（n=3）Tab.2 Results of the content determination of astragaloside Ⅳby two methods（n=3）

3 討論

3.1 前處理過程優(yōu)化

黃芪中黃芪甲苷的來源包括黃芪甲苷衍生物的轉(zhuǎn)化及游離的黃芪甲苷，兩者總和為黃芪甲苷的總含量。因此，黃芪中黃芪甲苷含量與黃芪甲苷衍生物轉(zhuǎn)化的程度有關(guān)，黃芪甲苷衍生物在堿的作用下被水解，轉(zhuǎn)化為游離黃芪甲苷，有利于準(zhǔn)確測(cè)定黃芪甲苷的含量［15］。

賴先榮等［16］采用在供試品中加入NaOH 至體積分?jǐn)?shù)為5%，然后加入水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，再依次加5%NaOH 溶液、水洗滌供試品，調(diào)節(jié)正丁醇溶液的酸堿度至中性的方式純化供試品。賈曉斌等［17］的研究結(jié)果表明，正丁醇萃取法和大孔吸附樹脂法純化后的指紋圖譜有一定差異，但黃芪總皂苷得率接近，表明2 種純化方法除去的雜質(zhì)有一定差異?？芍s、純化過程的關(guān)鍵在于堿化溶液的使用、飽和正丁醇萃取及大孔樹脂吸附步驟。

在前處理時(shí)加入的氨水或氨試液，可將黃芪醇類皂苷酯氨解為黃芪甲苷［18］，使得黃芪甲苷從絡(luò)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)［19-20］。本研究結(jié)果表明，氨水及氨試液洗脫可有效除去復(fù)方黃芪健脾口服液中的酸性雜質(zhì)。由此，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)中直接將氨水與口服液充分混勻后用大孔樹脂柱分離，再用氨試液洗脫，與現(xiàn)行含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)（萃取后用堿液對(duì)提取物進(jìn)行洗脫處理）方法相比，省去了萃取這一不穩(wěn)定步驟，前處理時(shí)間8 h 縮短至約3 h，不但提高了效率，同時(shí)也提高了供試品測(cè)定的準(zhǔn)確度及精密度。

3.2 檢測(cè)器選擇

制劑現(xiàn)行地方標(biāo)準(zhǔn)中采用了薄層色譜法測(cè)定黃芪甲苷含量，步驟煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，僅供試品前處理就需耗時(shí)8 h 以上，且測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差。ELSD 法幾乎無流動(dòng)相溶劑干擾，對(duì)被測(cè)成分無特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求，尤其適用于黃芪甲苷此類無特定吸收波長，紫外末端吸收的情況，故2015 年版《中國藥典》以后收載的含中藥黃芪的中藥成方制劑質(zhì)量控制方法均改用HPLC 法，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC-ELSD 法在前處理時(shí)簡化了原地方標(biāo)準(zhǔn)中供試品前處理步驟，將氨水直接與口服液混合后進(jìn)行大孔吸附樹脂洗脫，省去了萃取步驟，大幅縮短了測(cè)定時(shí)間，操作簡便，且方法專屬性強(qiáng)，精密度高，重復(fù)性良好，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。