GGT1 基因SNP 預(yù)測乳腺癌術(shù)后EC-T 化療方案血液系統(tǒng)毒性臨床研究*

沐 宇，彭 瑞，梁興忠，石祥奎，吳昕雨，胡書群，黃 亭△

（1. 江蘇省徐州市婦幼保健院·徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院，江蘇 徐州 221000； 2. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000）

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，全世界每年約有120萬女性患者確診。早期原發(fā)灶經(jīng)手術(shù)切除后，輔以化學(xué)藥物治療（簡稱化療）是消除術(shù)中殘余和全身散在癌細(xì)胞（血源性轉(zhuǎn)移）的有效手段，可顯著降低復(fù)發(fā)概率［1］，但必須警惕化療引起的毒性反應(yīng)。相關(guān)研究表明，遺傳因素是增加化療毒性的重要原因之一［2］。其中，單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的遺傳學(xué)改變。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶1（GGT1）基因位于人類第22 號染色體，GGT 通常分布于導(dǎo)管和腺體表面，在肝、腎、胰腺等分泌活躍的細(xì)胞上表達(dá)較多，GGT 對于維持機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［3］。GSH作為抗氧化劑，能中和氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，GGT 依賴的促氧化反應(yīng)能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，在腫瘤細(xì)胞的生長過程中扮演重要角色［4］。GGT 在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，并影響了患者的化療耐藥和預(yù)后［5-6］。表柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺序貫紫杉醇類制劑（EC-T）方案是臨床廣泛采用的乳腺癌術(shù)后輔助化療的一線方案，但同時會引起許多藥品不良反應(yīng)，其中骨髓抑制是其劑量限制性藥品不良反應(yīng)，常表現(xiàn)為白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少，制約著化療劑量和化療周期的實施，影響腫瘤的緩解率與治愈率［7］。為此，本研究中探討了乳腺癌患者GGT1基因SNP 與術(shù)后EC - T 化療方案血液系統(tǒng)毒性的相關(guān)性，以期為乳腺癌術(shù)后化療患者血液毒性的預(yù)防提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18歲且3代以內(nèi)親屬無乳腺癌病史；經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)后病理檢查確診為原發(fā)浸潤性乳腺癌，至少有1個可測量病灶；美國東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）評分≤2 分，卡氏（KPS）評分＞75 分；化療前各項臨床指標(biāo)均達(dá)標(biāo)（血紅蛋白≥80 g/ L，白細(xì)胞計數(shù)≥1.5 ×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血肌酐均不超過正常上限值的1.5 倍，肌酐清除率≥60 mL/ min，心電圖示心律正常）；術(shù)后接受EC-T序貫化療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：已出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤；患乳腺癌，且既往有化療、放射治療或伽馬刀等治療史；妊娠期或哺乳期；對本研究中擬用藥物過敏；血液系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重疾病，包括嚴(yán)重糖尿病、重度高血壓，6個月內(nèi)出現(xiàn)過心力衰竭，以及有心肌梗死史等。

病例選擇：收集徐州市婦幼保健院乳腺外科2021年1月至12月接受EC-T 化療方案的乳腺癌術(shù)后患者60例。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 基因測序及分型

采集患者外周靜脈血2 mL，采用Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程＜上海＞有限公司，簡稱生工生物公司）提取DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，產(chǎn)物置- 20 ℃冰箱中保存。選取rs5751901 和rs2017869 兩個SNP 位點(diǎn)，以rs5751901 上游引物5′ -ACCATAGGCAGAGTAAGGACCTG - 3′和下游引物5′ - AGCAGCCAAGGAAGGCCAA - 3′，rs2017869 上游引物5′-GATGGCAGTTCGGGATGTCATGC-3′和下游引物5′ - ACACCAGGAAGGCTGTGCAAAC - 3′進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），且目的片段長度均為201 bp，反應(yīng)體系為10 × Buffer 5 μL（含MgCl2），dNTP 5.0 μL（10 mmol/L），上下游引物各2.5 μL（10 μmol/L），Taq DNA 聚合酶1.0 μL（5 U/μL），DNA 模板9.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃5 min終止反應(yīng)。

取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加1 μL Loading Buffer 混合，加樣于2.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行水平電泳（電壓80 V，時間40 min）DNA Marker 為堿基量標(biāo)準(zhǔn)。觀察在201 bp處出現(xiàn)條帶且其他位置處無干擾條帶即為PCR 擴(kuò)增成功。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行基因測序（生工生物公司）確定基因型。

1.3 EC-T 序貫化療方案

均以21 d 為1 個周期。第1～4 個周期，第1 天予注射用鹽酸表柔比星（山東新時代藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20123260，規(guī)格為每支10 mg）90 mg/ m2和注射用環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023686，規(guī)格為每支200 mg）600 mg/m2；第5～8 個周期，周期第1 天均予紫杉類藥物，包括多西他賽注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020543，規(guī)格為每支20 mg）75 mg/m2；或紫杉醇注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20053001，規(guī)格為每支30 mg）175 mg/m2；或注射用紫杉醇（白蛋白結(jié)合型，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20183378，規(guī)格為每支100 mg）260 mg/m2；或注射用紫杉醇脂質(zhì)體（南京綠葉制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030357，規(guī)格為每支30 mg）135～175 mg/m2。

1.4 資料收集

收集患者的人口學(xué)資料（包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)＜BMI ＞、個人疾病史、吸煙史、家族史等）和臨床資料（包括TNM 分期、分化情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、化療方案等）。記錄患者的基因型分布及化療過程中各項毒性反應(yīng)（包括中性粒細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、血紅蛋白減少、血小板減少）發(fā)生情況，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）抗癌藥物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)分級。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以X±s表示，行t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗。以χ2擬合優(yōu)度檢驗驗證各SNP 基因型是否符合Hardy -Weinberg 平衡；以χ2檢驗比較各基因型與不良反應(yīng)間的關(guān)系；以Logistic 回歸分析比值比（OR）及其95%置信區(qū)間（CI）表示相對危險度（以野生型默認(rèn)風(fēng)險為1，分析雜合突變型和純合突變型的相對風(fēng)險）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GGT1 SNP 基因型分布

GGT1rs5751901 位點(diǎn)共檢出2 種等位基因（C，T）和3 種基因型（TT 型、TC 型、CC 型），rs2017869 位點(diǎn)共檢出2 種等位基因（C，G）和3 種基因型（GG 型、GC 型、CC 型），基因型分布見表1［基因頻率=該基因的總數(shù)/（該基因的總數(shù)+ 等位基因的總數(shù)），其中頻率最低的為最小等位基因頻率］，均符合Hardy - Weinberg 平衡定律（P＞0.05）。表明樣本來自同一孟德爾遺傳群體，具有群體代表性。

表1 GGT1 SNP基因型分布Tab.1 Distribution of genotypes of GGT1 gene with SNP

2.2 GGT1 SNP 與藥物毒性嚴(yán)重程度的相關(guān)性

出現(xiàn)2 級及以上中性粒細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、血紅蛋白減少、血小板減少的患者分別有43例（71.67%）、48例（80.00%）、34例（56.67%）、8例（13.33%）。

Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，對于rs5751901 位點(diǎn)，與TT型+TC型患者比較，CC型患者出現(xiàn)2級及以上中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險顯著降低（P＜0.05）；與TT 型+CC 型患者比較，TC 型患者出現(xiàn)2 級及以上中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險顯著升高（P＜0.05），但經(jīng)年齡、BMI、月經(jīng)狀態(tài)等因素校正后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 GGT1 SNP與中性粒細(xì)胞減少嚴(yán)重程度的相關(guān)性Tab.2 Correlation between SNP of GGT1 and severity of neutropenia

對于rs5751901 位點(diǎn)，與TT 型+ TC 型患者比較，CC 型患者出現(xiàn)2 級及以上白細(xì)胞減少的風(fēng)險顯著降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 GGT1 SNP與白細(xì)胞減少嚴(yán)重程度的相關(guān)性Tab.3 Correlation between SNP of GGT1 and severity of leukopenia

對于rs2017869 位點(diǎn)，與GG 型和GG 型+ GC 型患者比較，CC 型患者出現(xiàn)2 級及以上血紅蛋白減少的風(fēng)險顯著降低（P＜0.05）。詳見表4。兩位點(diǎn)與血小板減少嚴(yán)重程度無顯著相關(guān)性。詳見表5。

表4 GGT1 SNP與血紅蛋白減少嚴(yán)重程度的相關(guān)性Tab.4 Correlation between SNP of GGT1 and severity of hemoglobin reduction

表5 GGT1 SNP與血小板減少嚴(yán)重程度的相關(guān)性Tab.5 Correlation between SNP of GGT1 and severity of thrombocytopenia

3 討論

GGT 能將細(xì)胞外的GSH 水解為谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，使細(xì)胞回收利用氨基酸［3］，GGT/ GSH 為細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分［8］。GGT 抗氧化和促氧化功能間可能存在平衡，當(dāng)細(xì)胞GGT 過表達(dá)或在氧化還原因子的存在下，促氧化作用可能更占優(yōu)勢，其促氧化活性有助于腫瘤組織保持持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，并參與細(xì)胞增殖/ 凋亡等腫瘤進(jìn)程，以及產(chǎn)生耐藥［9］。在乳腺癌中，GGT 高活性與預(yù)后不良因素（雌激素受體陰性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）顯著相關(guān)，GGT 陰性的乳腺癌患者預(yù)后更好，對于原發(fā)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，治療前血清高GGT 水平與較低的5 年總體生存率顯著相關(guān)［10］。研究表明，血清GGT水平受環(huán)境因素和遺傳因素雙重調(diào)控，且其遺傳力為61%［11］。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已在不同種群中證實了GGT1SNP 與血清GGT表達(dá)水平間的相關(guān)性，SNP 會影響GGT 在組織和血清中的水平，最終影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和化療效果［11-12］。

目前，關(guān)于GGT1SNP 的研究多集中在rs5751901，rs2017869，rs8135987 這3 個位點(diǎn)。KHRUNIN 等［13］在卵巢癌化療患者中研究了GGT1與藥物毒性反應(yīng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在接受順鉑化療期間，攜帶rs5751901 TT型的患者發(fā)生腎毒性的風(fēng)險有增加趨勢。但鮮有乳腺癌術(shù)后化療中GGT1SNP和化療毒性是否存在相關(guān)性的研究。EC-T方案為乳腺癌術(shù)后常用化療方案，其引起的血液毒性備受臨床關(guān)注，同時藥物基因組學(xué)的發(fā)展也為EC - T的不良反應(yīng)研究提供了幫助［14-15］。本研究中，患者化療后出現(xiàn)的主要血液毒性是中性粒細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、血紅蛋白減少和血小板減少。Logistic 回歸分析顯示，中性粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少主要與rs5751901位點(diǎn)有關(guān)，血紅蛋白減少主要與rs2017869位點(diǎn)有關(guān)，血小板減少與此兩位點(diǎn)可能無關(guān)。攜帶rs2017869 CC 型對于乳腺癌術(shù)后患者經(jīng)EC-T 化療后出現(xiàn)的血紅蛋白減少為保護(hù)因素；攜帶rs5751901 CC 型的患者化療后出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少的風(fēng)險更低，攜帶rs5751901 TC 型的患者化療后出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險更低。因此，對于攜帶rs5751901 TT 型+ TC 型患者，化療前需嚴(yán)格把握化療對血液指標(biāo)的要求，同時化療過程中應(yīng)密切監(jiān)測血常規(guī)，警惕3度、4度中性粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少出現(xiàn)。MELZER 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，rs5751901 的CC 型與血清GGT 水平相關(guān)，每個少見等位基因會增加0.21個標(biāo)準(zhǔn)差增量，證實了GGT1SNP 與血清GGT 水平間的相關(guān)性。根據(jù)本研究結(jié)論可進(jìn)一步推論，血清GGT 高水平的患者出現(xiàn)3 度、4 度中性粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少的風(fēng)險較小，這一相似結(jié)論在鼠模型中也被證實［17］。不可否認(rèn)的是，EC-T 化療方案由于藥物自身的特點(diǎn)，引起的血液毒性普遍較嚴(yán)重，而單一的SNP位點(diǎn)對其影響可能有限，或存在假陽性/假陰性的結(jié)果，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗證。

綜上所述，乳腺癌術(shù)后EC-T 化療患者GGT1SNP和化療血液毒性存在一定相關(guān)性，GGT1SNP 在血液毒性的預(yù)測和盡早干預(yù)方面具有潛在價值。本研究中的患者化療后血小板減少發(fā)生率較低，可能與樣本量偏小有關(guān)，下一步將擴(kuò)大樣本量對上述結(jié)果進(jìn)行證實，并進(jìn)一步在細(xì)胞水平揭示GGT1SNP 對GGT 蛋白功能的影響及其機(jī)制。