金蓮清熱泡騰片抗流感病毒體內外藥效實驗及作用機制研究

崔南南 耿麗波 王虹艷 竇啟玲 竇雅琪

1.天津市海河醫(yī)院，天津 300000；2.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州貴陽 550000

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強、傳播速度快的疾病。典型的臨床癥狀為急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。該病由流感病毒引起，可分為甲、乙、丙、丁四型，其中甲型病毒經(jīng)常發(fā)生抗原變異，傳染性大、傳播迅速，極易發(fā)生大范圍流行[1-2]。

抗病毒治療是流感治療的主要策略，主要抗病毒藥物有奧司他韋、扎那米韋等。這類藥物在有效治療流感的同時，不良反應較大，且容易產生耐藥性，限制其臨床應用，特別是兒童[3]。金蓮清熱泡騰片為泡騰片中藥劑型，具有清熱解毒，利咽生津，止咳祛痰等功效。主治外感熱證，癥見高熱、口渴、咽干、咽痛、咳嗽、痰稠，亦適用于流行性感冒、上呼吸道感染有上述證候者[4]。本研究針對金蓮清熱泡騰片治療流感的系統(tǒng)藥效學進行研究，為金蓮清熱泡騰片臨床用于流感治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞及病毒株

狗腎（madin darby canine kidney，MDCK）細胞，引自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

甲1 型 流 感 病 毒NYMCX-179A 株、甲3 型流感病毒NYMCX-327 株和乙型流感病毒株（B/Phuket/3073/2013）均購自英國國家生物制品檢定。

1.2 實驗動物

BALB/c 雌性小鼠（SPF 級），體重12 ～15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產許可證號：SCXK（京）2019.0008]。本實驗所有實驗動物均嚴格遵循《實驗動物的使用管理程序》，并于生物安全實驗室（BSL.Ⅱ）中完成。

1.3 藥物及試劑

金蓮清熱泡騰片未加輔料的浸膏36.37 g（批號：1912014）、金蓮清熱泡騰片（國藥準字Z20103076，規(guī)格：4 g/片，批號：1912030），天津中盛海天制藥有限公司生產；奧司他韋（達菲）（國藥準字J20140121，規(guī)格：75 mg，批號：SOT-190704），上海羅氏制藥有限公司；Influenza A Virus H1N1 HA antibody，武漢賽維爾；Biotin-conjugated AffiniyureGaot Anti-Mouse IgG（H+L），武漢三鷹。

2 方法

2.1 體外抗流感藥效實驗

預防模式MDCK 細胞加入受試藥TD0濃度（5 mg/ml）作連續(xù)2 倍系列稀釋的高、中、低3 個濃度，孵育2 h，加入病毒吸附2 h 后，加入MEM培養(yǎng)基；治療模式加入100 病毒滴度（TCID50）病毒（100 μl/孔），孵育2 h，使病毒進入細胞內，用DMEM 液洗去游離病毒，加入稀釋的藥物樣品（5 mg/ml），37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。設立細胞對照、病毒對照和空白對照孔，陽性對照藥為奧司他韋，記錄細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench 法計算能抑制50% CPE 產生的藥物有效濃度（EC50）。

治療模式分別在感染病毒后0、2、4、6、8、10、12 h 加入藥物，孵育后，棄去藥物，用PBS（phosphate buffer saline）沖洗2 次，加入MEM 培養(yǎng)基，每個時間點設病毒感染對照組。12 h 后，測定各時間點的TCID50。

2.2 體內抗流感藥效實驗

Balb/c 小鼠隨機分為4 組，每組6 只。將病毒尿囊液用病毒稀釋液按100、10-1、10-2梯度稀釋后對小鼠滴鼻10 μl，對照組小鼠用10 μl 稀釋液滴鼻。連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠的死亡情況，觀察小鼠肺組織病理變化。

按照隨機數(shù)表法隨機分為6 組，金蓮清熱泡騰片組[80 mg/（次·只）、60 mg/（次·只）、40 mg/（次·只）]、陽性藥物（奧司他韋）對照組[75 μg/（次·只）]、模型對照組、空白對照組。金蓮清熱泡騰片組在造模后24 h 給藥，3 次/d；陽性藥物對照組，1 次/d；模型對照組和空白對照組不做任何處理。每天觀察記錄小鼠體重、皮毛變化和死亡情況，計算小鼠存活率、生存時間等指標評分。

各組分別于感染后第2、4、6、8 天，隨機選取4 只小鼠麻醉后處死，解剖觀察肺部病變，取右肺勻漿，離心（12 000 rpm，4℃）5 min 后，收集上清液，CPE 法和MTT 法測定其TCID50。PBS 10 倍稀釋后，接種到9 ～11 d 齡雞胚，48 h 后采集尿囊液，血球凝集（hemagglutination，HA）法檢測。

各組小鼠治療5 d 后，在第6 天脫頸處死，無菌條件下取小鼠肺臟，勻漿，進行蛋白免疫印跡技術（Western Blot，WB）實驗，檢測肺組織中H1N1 病毒HA 蛋白表達量。

3 結果

3.1 藥物細胞毒性及病毒TCID50測定結果

CPE 法和MTT 法檢測結果均顯示，金蓮清熱泡騰片浸膏TD50為10 mg/ml、TD0為5 mg/ml。奧司他韋TD50為100 μg/ml、TD0為75 μg/ml。

三個毒株的TCID50均為10-4，即該病毒稀釋10-4接種可使50%細胞發(fā)生病變。

3.2 預防模式體外抗病毒實驗結果（CPE法）

在預防模式中，金蓮清熱泡騰片高、中、低3 個濃度均能明顯抑制甲1 型流感病毒NYMCX-179A株10 TCID50、甲3 型流感病毒NYMCX-327 株10 TCID50、乙型流感病毒株（B/Phuket/3073/2013）100 TCID50引起的細胞病變，金蓮清熱泡騰片高、中濃度組作用效果均比奧司他韋強。

金蓮清熱泡騰片抗甲1 型流感病毒的最高稀釋滴度為10-1TCID50/ml，抗甲3 型流感病毒的最高稀釋滴度為10-2TCID50/ml，抗乙型流感病毒的最高稀釋滴度為10-2TCID50/ml，均明顯低于奧司他韋3 個流感病毒的滴度10-3TCID50/ml，見表1。

表1 金蓮清熱泡騰片體外抗病毒實驗TCID50檢測結果（CPE法）

3.3 不同接種時間體外抗流感病毒實驗結果

在接種病毒不同時間后加入藥物（5 mg/ml），觀察細胞病變情況。分別利用MTT 法和CPE 法測定金蓮清熱泡騰片作用不同時間的TCID50（表2 ～3），結果顯示藥物抗甲型流感病毒株作用在病毒感染的全復制周期均有效，主要是在感染6 h 后作用明顯，此時OD值明顯上升，子病毒量明顯下降，但其在病毒感染初期的作用不如奧司他韋。

表2 藥物抗甲型流感病毒株不同作用時間點給藥作用結果（MTT法）

表3 藥物抗甲型流感病毒株不同作用時間點給藥作用結果（CPE法）

3.4 體內抗甲型流感病毒實驗結果

3.4.1 病毒半數(shù)致死量（LD50）檢測 按照Reed-Muench 法計算LD50得出結論，該病毒液進行10-1.5稀釋后，每只小鼠滴鼻10 μl，可使50%的小鼠致死，見表4。

表4 尿囊液稀釋液滴鼻小鼠后小鼠死亡情況（n=6）

3.4.2 各組小鼠體重變化、存活率、生存時間等發(fā)病評分 金蓮清熱泡騰片高、中劑量組和奧司他韋治療組終末體重無差異，金蓮清熱泡騰片低劑量組體重高于奧司他韋治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），說明金蓮清熱泡騰片及奧司他韋治療H1N1 感染均有一定療效。H1N1 模型組小鼠在感染病毒后6 ～10 d出現(xiàn)死亡，且感染后第8 天出現(xiàn)死亡高峰，金蓮清熱泡騰片高、中、低劑量組小鼠均未死亡。見表5。

表5 小鼠體重變化及死亡情況統(tǒng)計（n=8）

3.4.3 各組小鼠肺組織病理切片 與空白對照組相比，H1N1 病毒感染組的動物肺病變在感染后4 ～6 d 最嚴重，肺部網(wǎng)狀結構基本消失，肺泡壁增厚，肺泡上皮損傷、脫落，肺泡間毛細血管嚴重充血，肺間隔中有大量的炎性細胞浸潤。金蓮清熱泡騰片組在開始治療后能減輕肺病變，在治療第2 天雖有較明顯的肺病變，但是較模型組明顯改善，在治療第4 ～6 天療效顯著，治療第6 天接近正常肺，有較為清晰的網(wǎng)狀結構。金蓮清熱泡騰片組治療過程中，低劑量組有效，但有一定的劑量-效應關系，高劑量組優(yōu)于中、低劑量組，優(yōu)于奧司他韋治療組。見圖1。

3.4.4 肺組織中H1N1 病毒的TCID50檢測結果 金蓮清熱泡騰片高、中劑量組的活病毒數(shù)量明顯低于金蓮清熱泡騰片低劑量組和奧司他韋治療組（CPE法）；金蓮清熱泡騰片高劑量組治療第2、4、6 天細胞的OD值明顯高于奧司他韋治療組和H1N1 病毒感染組；金蓮清熱泡騰片高、中劑量組第6 天細胞的OD值明顯高于奧司他韋治療組和H1N1病毒感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（MTT 法），說明金蓮清熱泡騰片高、中劑量組有明顯的抗H1N1 病毒作用，并強于奧司他韋治療組（表6 ～7）。

表6 肺組織中H1N1TCID50（CPE法）

表7 MTT法檢測各組肺組織中H1N1活病毒的含量（OD值）

HA 法結果顯示，金蓮清熱泡騰片治療組在第4 天，金蓮清熱泡騰片高、中劑量組血凝價開始降低，在第6 天金蓮清熱泡騰片高劑量組病毒液的血凝價呈陰性，金蓮清熱泡騰片低劑量組病毒液的血凝價為1 ∶160，和奧司他韋治療組的血凝價相同。在第8 天金蓮清熱泡騰片各治療組病毒液的血凝價均為陰性，說明金蓮清熱泡騰片高、中劑量組的抗H1N1 病毒作用高于奧司他韋治療組。見表8。

表8 肺組織中H1N1病毒的TCID50（HA法）

3.4.6 WB 實驗檢測肺組織中H1N1 病毒HA 蛋白 H1N1病毒HA 蛋白檢測結果見圖2 ～3，顯示各金蓮清熱泡騰片劑量組肺組織的HA 蛋白表達量明顯低于H1N1 病毒感染組，金蓮清熱泡騰片高劑量組比金蓮清熱泡騰片低劑量和奧司他韋治療組的HA 蛋白表達量減少更為明顯，說明金蓮清熱泡騰片能明顯抑制H1N1 病毒在肺組織中的HA 蛋白表達。

圖2 WB 檢測肺組織中H1N1 病毒蛋白相對豐度比較

圖3 WB 檢測肺組織中H1N1 病毒蛋白（HA）

4 討論

流行性感冒作為一種由流感病毒導致的急性呼吸道疾病，其感染性強、傳播途徑廣，各類人群普遍易感染[5]。當前在流感治療上，抗病毒藥物長期使用極易產生耐藥性[6]。中藥、中成藥和中藥制劑可以通過多途徑、多靶點綜合抑制病毒在體內的繁殖，從而達到預防和治療流感的效果[7-8]。

金蓮清熱泡騰片作為具有清熱解毒、利咽生津等藥效的中藥制劑，其主要成分為金蓮花、大青葉、石膏、知母、地黃、玄參和苦杏仁（炒）[9]，對于流行性感冒具有較好的治療效果，雖然也有應用于治療小兒咽峽炎、手足口病、上呼吸道感染等疾病的報道[10-12]，但是由于缺乏綜合性的藥效循證證據(jù)，使其在臨床應用上未能充分發(fā)揮價值。

本研究利用MDCK 細胞株和三個流感病毒株探究金蓮清熱泡騰片的體外抗病毒活性，同時還構建了甲型流感病毒株感染BALB/c 小鼠模型以驗證金蓮清熱泡騰片的體內抗病毒活性。結果顯示金蓮清熱泡騰片對于三種病毒株均具有抑制作用，在與傳統(tǒng)治療流感藥物奧司他韋的比較中，金蓮清熱泡騰片對三種病毒株的藥效均高于奧司他韋，且金蓮清熱泡騰片的低劑量藥效也與奧司他韋的藥效相似。本研究還探究金蓮清熱泡騰片在不同時間點給藥對甲型流感病毒株的作用，結果顯示奧司他韋在MDCK 細胞感染病毒初期的藥效較好，但是在感染6 h 之后，金蓮清熱泡騰片的藥效開始逐漸強于奧司他韋。此外，在進行三種病毒株TCID50實驗時，發(fā)現(xiàn)金蓮清熱泡騰片對于甲1 型病毒、甲3 型病毒和乙型病毒的最高稀釋滴度（即子病毒量）并不相同，但是與奧司他韋相比，金蓮清熱泡騰片的最高稀釋滴度均更低。細胞在感染甲1 型病毒染毒后的12 h 內，金蓮清熱泡騰片不同時間點給藥結果顯示，甲1 型病毒的子病毒量均低于奧司他韋給藥后的量，這也證明金蓮清熱泡騰片在甲1 型病毒感染后的病毒全復制周期均有抑制作用，尤其在感染后6 h 給藥藥效最好、病毒的子病毒量下降最為明顯。此外，本研究還對金蓮清熱泡騰片進行了體內藥效實驗研究，構建的甲型H1N1 流感病毒小鼠模型在染毒后6 ～10 d 出現(xiàn)死亡，而金蓮清熱泡騰片組小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；并且通過觀察小鼠肺部病變情況發(fā)現(xiàn)，金蓮泡騰片組的小鼠在干預治療第2 天即可減輕肺部組織病變癥狀，在治療第6 天已經(jīng)恢復至接近正常肺，并且金蓮泡騰片低、中、高濃度組對于肺部感染情況均有明顯治療效果[13-16]。

本研究通過金蓮清熱泡騰片體內外治療流感的藥效學實驗，證明了金蓮清熱泡騰片抗病毒的活性，為金蓮清熱泡騰片的臨床應用提供科學依據(jù)，為抗流感病毒的中藥研發(fā)開拓思路。