miRNA-647在乳腺癌中的作用研究

高 宇 金春明 鄧 夢(mèng) 丁鑫哲 張 航 徐春艷

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，黑龍江牡丹江 157000；3.黑龍江省牡丹江市腫瘤醫(yī)院病理科，黑龍江牡丹江 157000

乳腺癌（breast cancer，BC）占所有女性癌癥病死人數(shù)的15%～20%[1]。BC 與關(guān)鍵的癌癥特征有關(guān)，包括持續(xù)增殖、逃避凋亡、增強(qiáng)轉(zhuǎn)移等。BC 的分子機(jī)制仍有待研究，迫切需要診斷治療BC 的有效分子靶點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用[2-3]并與癌癥患者的診斷、治療相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-647 對(duì)胃癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤類疾病能夠起到顯著的抑制作用[4-5]，提示miR-647 可能是廣泛存在的抑癌基因，在癌癥治療中起關(guān)鍵作用。然而miR-647在BC 中的作用還不清楚，本研究對(duì)miR-647 在BC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定分析，對(duì)比其在BC 組織和癌旁組織，BC 細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性；同時(shí)探討miR-647 過(guò)表達(dá)對(duì)BC 細(xì)胞增殖能力、遷移能力、凋亡和周期的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果表明，miR-647 在BC 組織及其細(xì)胞系中可能發(fā)揮著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，這將會(huì)是未來(lái)臨床治療BC 的一個(gè)全新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本 收集2021 年6 月至2022 年9 月牡丹江市腫瘤醫(yī)院的28 例BC 患者的BC 組織和癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞 BC 細(xì)胞系（MCF-7、MB-MDA-231、SK-BR3）和正常細(xì)胞系（MCF-10A）均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7、MDA-MB-231 兩種細(xì)胞置于MEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育。將SK-BR3、MCF-10A兩種細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MCF-7 細(xì)胞鋪于6 孔板中并培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染人工合成miR-NC（陰性對(duì)照序列）、miR-647 mimics 模擬物，命名為miR-NC 組、miR-647 mimics 組。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測(cè)miR-647 表 達(dá) 水 平 運(yùn) 用qRT-PCR 擴(kuò)增待檢測(cè)基因并分析數(shù)據(jù)。相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 在24、48、72、96 h 時(shí)，每孔加入一定量CCK-8 檢測(cè)液并測(cè)定其在波長(zhǎng)為450 nm處的OD 值。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 長(zhǎng)滿細(xì)胞后沿中軸劃“十”字線，依次在0、24、48 h 時(shí)用顯微鏡進(jìn)行拍照，按照遷移速率繪制柱形圖。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 每管中加入1×Binding Buffer 工作液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 每管加入染色工作液置于無(wú)光條件下進(jìn)行水浴處理，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)及四分位間距[M（P25，P75）]表示。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-647在BC組織中表達(dá)情況

采用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)BC 組織（n=28）和癌旁組織（n=28）中miR-647 的表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-647 在BC 組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1.00（0.61，1.24）vs.0.50（0.30，0.72），P＜ 0.001]。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-647 在癌旁組織和乳腺癌組織中相對(duì)表達(dá)水平比較（＊＊＊表示P ＜ 0.001）

2.2 miR-647在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況

用qRT-PCR 檢測(cè)MCF-10A 和MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR3 中miR-647 的表達(dá)。結(jié)果表明與MCF-10A 相比，miR-647 在MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR3 中的表達(dá)均降低。并且在MCF-7 細(xì)胞中降低更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。所以選擇MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行研究。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-647 在不同細(xì)胞系中的表達(dá)差異情況（＊＊表示P ＜ 0.01）

2.3 miR-647對(duì)BC細(xì)胞增殖和遷移的影響

為了調(diào)節(jié)miR-647 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-647 模擬物到MCF-7 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-647 mimics 組與miR-NC組相比，miR-647 的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.00±0.01）vs. （36.54±10.08），P=0.008]（圖3A）。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與miR-NC 組相比，miR-647 mimics 組顯著抑制細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.51±0.08）vs. （0.86±0.03），P=0.001）]（圖3B）。細(xì)胞劃痕結(jié)果表明與miR-NC 組相比，miR-647 mimics組細(xì)胞遷移能力明顯下降，對(duì)細(xì)胞遷移過(guò)程產(chǎn)生了一定的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.39±0.02）vs. （0.23±0.04），P=0.011）]（圖3C）。

圖3 miR-647 對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖和遷移的影響

2.4 miR-647對(duì)BC細(xì)胞凋亡和周期的影響

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-647 過(guò)表達(dá)促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.87±0.26）%vs. （2.89±0.27）%，P＜ 0.0001）]（圖4A）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于miR-NC 組，miR-647 mimics 組G0/G1 期比例上升，S 期比例下調(diào)，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（38.37±0.21）%vs.（48.67±2.16）%，P=0.005）]（圖4B）。

圖4 miR-647 對(duì)BC 細(xì)胞凋亡和周期的影響

3 討論

BC 是常見(jiàn)的癌癥之一，是一種嚴(yán)重影響婦女健康的致死性疾病。傳統(tǒng)治療方法為外科手術(shù)，化療和放療等，但是治療效果仍有欠缺。因此尋找有效的治療靶點(diǎn)，探究其在BC 中的作用才能更有效的診斷治療BC。在癌癥中，失調(diào)的miRNA表達(dá)可以檢測(cè)腫瘤的發(fā)展情況，包括細(xì)胞增殖，遷移，凋亡等。一些miRNA 可作為抑癌基因，而另一些則作為癌基因[6]。有研究表明一些miRNA 在BC 中異常表達(dá)，如miR-21、miR-155、miR-let-7b-5P 等[7-9]。Qin 等[10]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，miR-647 通 過(guò)靶向HOXA9 對(duì)細(xì)胞增殖和遷移起到一定的抑制作用。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-647 對(duì)癌細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程起到一定的抑制作用[11]。然而另有研究顯示，miR-647 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)[12]。在肝癌細(xì)胞中miR-647 的表達(dá)水平高于正常細(xì)胞并且介導(dǎo)的PTPRF 表達(dá)下調(diào)影響HCV-huh 7.5 細(xì)胞中的Erk 信號(hào)通路[13]。這些結(jié)果表明，在不同類型的癌癥中，miR-647 調(diào)控的分子靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)不同，可以作為癌或抑癌基因參加調(diào)控。

為了探究miR-647 在BC 中的表達(dá)情況和功能作用，首先本研究采用qRT-PCR 檢測(cè)了miR-647 在BC 組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-647 在BC組織顯著下調(diào)。為了進(jìn)一步了解miR-647 對(duì)BC細(xì)胞的影響，檢測(cè)miR-647 在BC 細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-647 在BC 細(xì)胞中顯著下降，與其在BC 組織中的結(jié)果相一致。從而證明miR-647在BC 中可能為抑癌基因。有發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清miR-647 表達(dá)顯著低于正常人，miR-647 過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生一定的抑制作用[14]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)miR-647 調(diào)控血清反應(yīng)因子/肌球蛋白重鏈9（SRF/MYH9）信號(hào)軸抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。然而miR-647 在BC 細(xì)胞中的生物學(xué)作用還不清楚，通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-647 過(guò)表達(dá)抑制BC 細(xì)胞增殖和遷移。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證明miR-647 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了miR-647 過(guò)表達(dá)使細(xì)胞從G0/G1 期到S 期受到了阻滯作用，進(jìn)而抑制BC 細(xì)胞增長(zhǎng)。綜上所述，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了miR-647 在多種癌癥中都發(fā)揮調(diào)控作用，因此本研究基礎(chǔ)穩(wěn)固，且本研究通過(guò)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-647 可抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性特征，這些結(jié)果表明miR-647 可能在BC 中起抑癌作用并且在BC 基因靶向治療中具有一定的作用，可為臨床提供BC 治療的新靶點(diǎn)。本研究未進(jìn)一步探究miR-647 下游靶基因及信號(hào)通路，猜測(cè)miR-647 可能在BC 的分子機(jī)制中具有一定的研究意義。