甲狀腺乳頭狀癌中IFI6的表達(dá)與臨床意義

韋 芳 陳 罡 蔣洪棉 肖小月

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧 530000；2.南寧市第一人民醫(yī)院病理科，廣西南寧 530000

甲狀腺癌是人類內(nèi)分泌系統(tǒng)常見惡性腫瘤，以甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）為主，占85%～90%，其發(fā)病率居全球第9 位，好發(fā)于青少年女性，且易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移[1]。近年來，我國(guó)PTC 發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且患者五年總體生存率（84.3%）與美國(guó)仍存在較大差距（98.4%）[2]。因此，需要進(jìn)一步研究與PTC 相關(guān)的分子標(biāo)志物，探尋特異性的診療及預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物。干擾素誘導(dǎo)蛋白6（interferon-inducible protein 6，IFI6）定位于線粒體，是最早鑒定出的干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）之 一。IFI6 編碼的蛋白質(zhì)在抗凋亡、抗病毒等方面起重要作用[3]。GEPIA 和Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示IFI6 mRNA 在多種腫瘤疾病中表達(dá)明顯上調(diào)，如胃癌、宮頸癌、乳腺癌等。然而，與PTC 相關(guān)的研究較少。本研究旨在通過免疫組化法檢測(cè)IFI6 蛋白在PTC 組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年8 月至2020 年8 月在南寧市第一人民醫(yī)院病理科確診為PTC 的77 例組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)癌旁組織。其中男17 例，女60 例；年齡20 ～82 歲，平均（46.70±13.20）歲。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committeeon Cancer，AJCC）第8 版癌癥分期手冊(cè)中分化型甲狀腺癌的分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，將患者分為≥55 歲和＜55 兩組；病理分期I 期69 例，Ⅱ期7 例，無Ⅲ、Ⅳ期病例，1 例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況記錄不詳，無法分期；經(jīng)典型PTC 37 例，微小型34 例，濾泡亞型5 例，透明型1 例。所有病例的HE 切片均經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)師復(fù)診。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2021-063-01）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：初發(fā)患者；原發(fā)腫瘤；術(shù)前未進(jìn)行放化療和內(nèi)分泌治療的患者；術(shù)后病理診斷為PTC的患者；臨床資料完整的患者；切片大小滿足本實(shí)驗(yàn)要求的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)患者；轉(zhuǎn)移癌；其他類型PTC 患者。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑 IFI6 兔抗多克隆抗體（Biorbyt公司，批號(hào)：orb247291）；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM3HRP 試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：2008175220G）。

1.2.2 方法 3 μm 薄切石蠟切片經(jīng)65℃恒溫箱烤片2 h，脫蠟至水。免疫組化染色采用SP 兩步法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判讀 胞漿中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒為IFI6 蛋白表達(dá)陽(yáng)性。由兩名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無表達(dá)、＜10%、10%～35%、36%～75%、＞75%各計(jì)0、1、2、3、4 分。染色強(qiáng)度評(píng)分：胞質(zhì)無著色或基本無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色各計(jì)0、1、2、3 分[5]。兩者乘積為總分；若兩人最終評(píng)分不一致，則取其平均分?？偡? ～3 分為低表達(dá)，4 ～12 分為高表達(dá)。

1.3 Kaplan-Meier plotter在線分析

利用Kaplan-Meier plotter 分 析IFI6 mRNA 表達(dá)水平與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。檢索條件：①IFI6；②auto select best cutoff；③OS 和RFS；④thyroid carcinoma。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用秩和檢驗(yàn)比較IFI6 蛋白在PTC 與癌旁組織中的表達(dá)差異；采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 精確概率法分析IFI6 蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系；采用GraphPad Prism v7 繪圖軟件進(jìn)行作圖。所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFI6蛋白在PTC及癌旁組織中的表達(dá)

IFI6 蛋白陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃至棕褐色顆粒染色，主要表達(dá)于PTC 組織中，部分表達(dá)于乳頭樣增生甲狀腺組織、淋巴濾泡及嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)。IFI6 蛋白在PTC 組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織[77 例PTC：4.5（3.0，8.0）；77 例癌旁：1.0（0.0，3.0），Z=7.236，P=0.000]，見圖1。

圖1 IFI6 蛋白在PTC 與癌旁組織中的表達(dá)（免疫組化SP 法，100×）

2.2 IFI6蛋白表達(dá)與PTC患者臨床特征單因素分析

IFI6 蛋白表達(dá)與PTC 患者年齡有關(guān)，＜55 歲者表達(dá)顯著高于≥55 歲者（P＜ 0.05）。IFI6 蛋白表達(dá)與性別、合并橋本氏甲狀腺炎（HT）、腫瘤直徑、病灶位置、病灶數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PTC 亞型及病理分期均無關(guān)（P＞ 0.05），見表1。

表1 IFI6蛋白表達(dá)與PTC患者臨床特征單因素分析

2.3 IFI6與PTC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier plotter 在線分析結(jié)果顯示，IFI6mRNA 高表達(dá)者預(yù)后較好，其中總生存期的HR為0.358（logrankP=0.035），無復(fù)發(fā)生存期的HR為0.316（logrankP=0.002），見圖2。

圖2 PTC 組織中IFI6 mRNA 表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

3 討論

IFI6 是一種ISGs，可被α 和β 干擾素高度誘導(dǎo)[3]。IFI6 在胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中表達(dá)升高，且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)他莫昔芬、順鉑、紫杉醇耐藥[6-7]。有研究表明，降低IFI6 表達(dá)，可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[8]、減少胰腺癌小鼠肺和肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積[9]；這揭示IFI6 用于靶向治療的潛力。這些研究表明IFI6可能是影響腫瘤形成與發(fā)展的關(guān)鍵癌基因。IFI6在腫瘤與正常組織中的差異表達(dá)，提示其可能對(duì)腫瘤性疾病有一定的區(qū)分能力。

目前，尚無文獻(xiàn)報(bào)道IFI6 蛋白在PTC 組織中的表達(dá)情況，其生物學(xué)特性也未知。本研究通過免疫組化方法，顯示IFI6 蛋白在PTC 組織中表達(dá)顯著上調(diào)，提示IFI6 可能參與PTC 的形成。此外，IFI6 高表達(dá)與年齡顯著相關(guān)。青少年和散發(fā)性結(jié)腸癌患者IFI6 表達(dá)水平顯著高于健康成人[10]。＜55 歲的PTC 患者IFI6 蛋白表達(dá)水平顯著高于≥55 歲者。AJCC 將PTC 分期的診斷年齡分界點(diǎn)由45 歲提至55 歲，主要是因?yàn)樵\斷年齡與預(yù)后息息相關(guān)。研究表明診斷年齡是PTC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，≥55 歲的PTC 患者預(yù)后更差[11]。這與本研究結(jié)果相符。PTC 已成為美國(guó)青少年發(fā)病率最高的惡性腫瘤。與老年P(guān)TC 患者相比，青少年患者更易發(fā)生局部區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則少見、預(yù)后較好[12]。Kaplan-Meier 生存率分析表明IFI6 mRNA 高表達(dá)的PTC 患者生存期更長(zhǎng)。本研究證據(jù)提示IFI6 高表達(dá)可能促進(jìn)PTC 的發(fā)生，在腫瘤初期發(fā)揮促癌的作用，但隨著腫瘤的演進(jìn)，PTC 細(xì)胞可能出現(xiàn)時(shí)間上異質(zhì)性，IFI6 高表達(dá)者反而獲得更好的預(yù)后。其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

PTC 的病因至今未明，電離輻射是目前唯一一致認(rèn)可的危險(xiǎn)因素，它可導(dǎo)致DNA 單鏈斷裂或雙鏈斷裂[13]。DNA 損傷可引起基因毒性應(yīng)激，并通過環(huán)GMP-AMP 合酶-STING 信號(hào)軸激活Ⅰ型干擾素的JAK/STAT 信號(hào)通路，誘導(dǎo)IFI6 表達(dá)上調(diào)[14-15]。上調(diào)IFI6 可減少輻射后細(xì)胞凋亡和活性氧的產(chǎn)生，從而促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖[16]。IFI6 通過下調(diào)活性氧，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[5]。一項(xiàng)HT 和PTC 合并HT 的差異基因分析報(bào)告顯示IFI6 與免疫和炎癥功能、氧化應(yīng)激和活性氧、DNA 損傷和修復(fù)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡有關(guān)[17]。綜上，推測(cè)IFI6 可能通過Ⅰ型干擾素信號(hào)通路被激活，下調(diào)活性氧，促進(jìn)PTC 的形成與發(fā)展。

然而，本文尚存在不足之處。本文樣本量有限，IFI6 過表達(dá)趨勢(shì)仍有待大樣本、多中心研究證實(shí)。IFI6 在PTC 進(jìn)展中的潛在作用及其機(jī)制亦有待深入探究。

綜上所述，IFI6 蛋白在PTC 中表達(dá)顯著升高，可能參與PTC 的發(fā)生、發(fā)展，有望成為PTC 潛在的診療和預(yù)后指標(biāo)。