YAP蛋白在神經(jīng)肌肉接頭中作用機制的研究

楊濱瑞,趙琳琳,汪煜楠,初婷婷,鄭永慧,張驚宇

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱150001)

YAP(yes-associated protein,yes相關(guān)蛋白)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子,其本質(zhì)為富脯氨酸磷蛋白,基因定位于人類染色體11q22區(qū),是調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄蛋白。近年相關(guān)文獻表明YAP及其通路與多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)。Xu等研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病小鼠模型中YAP呈低表達并引起星形膠質(zhì)細胞的早衰,而上述癥狀可被過度表達的CDK6部分改善[1]。以肌萎縮側(cè)索硬化為模型,在探究導致該模型中神經(jīng)元減少的原因時發(fā)現(xiàn),YAP水平隨著肌萎縮側(cè)索硬化疾病進展而逐漸遞減[2]。Watt等發(fā)現(xiàn)YAP與TEAD轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而對骨骼肌質(zhì)量產(chǎn)生促進作用[3]。YAP含量在運動神經(jīng)損傷后提高并有利于神經(jīng)源性肌肉萎縮的恢復(fù)。因此,激活YAP使肌肉體積縮小癥狀得以改善,以此為基礎(chǔ)為治療神經(jīng)肌肉疾病提供了新的方向[3]。Gong等發(fā)現(xiàn)YAP在腦損傷的過程中對神經(jīng)細胞具有保護作用,尤其在機體腦缺血損傷后的血腦屏障異常部分中尤為突出[4]。Ma等研究Hippo/YAP受ACTL6A調(diào)控并參與非小細胞肺癌的致病過程[5]。Zhu等發(fā)現(xiàn)miR-582-5p通過調(diào)控YAP/TAZ對非小細胞肺癌的進展產(chǎn)生影響[6]。Mia等探究心臟功能和結(jié)構(gòu)在YAP低表達時得以正常維系[7]。Wang等探究彌漫大B細胞淋巴瘤與糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)GPNMB參與彌漫大B細胞淋巴瘤的發(fā)生機制是以YAP1為靶點對Wnt/β-catenin信號通路進行調(diào)控[8]。Lundin等通過有關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)造血干細胞的表達需要YAP的參與[9]。Ai等發(fā)現(xiàn)YAP通過調(diào)節(jié)白血病抑制因子進而影響星形膠質(zhì)細胞的成熟[10]。Salloum等在探究肝纖維化進程中游離脂肪酸與YAP的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)肝纖維化的程度因脂肪酸激活YAP而加重,p38 MAPK參與此過程的調(diào)控[11]。Ou等研究發(fā)現(xiàn)ROCK1拮抗劑改善腸道纖維化的機制與YAP/TAZ的靶向抑制有關(guān)[12]。Ortillon等發(fā)現(xiàn)通過拮抗YAP的表達將有利于改善高糖對血管的不利影響[13]。心肌在高血糖時損傷且該過程受腎素受體調(diào)控,途徑為腎素受體-AMPK-YAP[14]。目前,YAP與神經(jīng)-肌肉接頭疾病的聯(lián)系研究相對較少。

神經(jīng)-肌肉接頭疾病是指神經(jīng)-肌肉接頭間傳遞功能障礙所引起的疾病,主要包括重癥肌無力和Lambert-Eaton肌無力綜合征等[15-17]。既往研究表明agrin作為一種聚集蛋白,可以調(diào)控突觸后膜的乙酰膽堿。Chakraborty等研究agrin調(diào)控YAP表達關(guān)系時發(fā)現(xiàn),agrin通過整合素聚焦黏附和Lrp4/MuSK受體介導的信號通路轉(zhuǎn)導基質(zhì)和細胞剛性信號,從而增強YAP的穩(wěn)定性和機械活性,同時agrin通過YAP依賴的轉(zhuǎn)錄可以誘導或增加腫瘤發(fā)生概率,證明agrin在細胞外基質(zhì)具有調(diào)節(jié)YAP表達的作用[18]。本研究通過在分化后的C2C12肌管中用AAV8表達shRNA敲低YAP,發(fā)現(xiàn)AChR聚集受到抑制,說明YAP可以獨立于肌管形成而調(diào)節(jié)NMJ形成。同時在實驗中還發(fā)現(xiàn)agrin信號通路可以減弱YAP磷酸化,促進YAP進入細胞核從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能,提供了更深入的機制研究,為相關(guān)疾病治療提供分子層面的指導意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料C2C12細胞,HEK293細胞,pAV-U6-GFP,Helper質(zhì)粒,pll3.1質(zhì)粒,agrin。

1.2 C2C12細胞培養(yǎng)選擇含量為20%、1%的幼牛澳洲血清和胚胎雞萃取物作為培養(yǎng)基DMEM的基質(zhì)原料,當細胞增殖融合程度為80%時,將培養(yǎng)基質(zhì)更換為馬血清(4%)的進行細胞引誘分化,時間為4天整,并每24 h觀察1次。

1.3 AAV8包裝純化將編碼scramble shRNA的質(zhì)粒與Rep/Cap和Helper質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染HEK293細胞獲得AAV8。細胞轉(zhuǎn)染后3天匯集裂解液與培養(yǎng)基。經(jīng)5次凍融循環(huán)和Benzonase處理后,培養(yǎng)基和裂解液組分混合物在4℃以轉(zhuǎn)速68 000 rpm進行碘克沙醇梯度離心2 h。Amicon 15-100000 MWCO過濾器對40%梯度進行提取濃縮,并通過qPCR進行定量。

1.4 C2C12細胞免疫熒光染色對細胞固定時應(yīng)添加4%的多聚甲醛(PFA)過夜。PBS溶液沖刷樣本0.5 h。25℃環(huán)境中,配比(5%BSA,2%TritonX-100,5%山羊血清PBS)浸泡細胞120 min,后12 h另加一抗與封閉緩沖液(環(huán)境溫度為4℃),再選用TritonX-100的PBS液(濃度2%),沖洗樣本60 min,次數(shù)為3次。在熒光二抗的參與下進行時長為60 min的室溫孵育,之后進行3次PBS沖洗,每次1 h且該過程使用的PBS應(yīng)含有2%TritonX-100。再染試劑選用DAPI。用防熒光淬滅封片劑安裝樣品,并用蓋玻片覆蓋。用蔡司共聚焦激光掃描顯微鏡收集Z系列圖像,并折疊成單張圖像。

1.5 Western blot和免疫共沉淀細胞裂解獲得裂解產(chǎn)物。通過SDS-PAGE電泳凝膠后,硝酸纖維素膜承載其分解產(chǎn)物。選用含有5%脫脂牛奶PBS封閉液處理樣本60 min,環(huán)境溫度4℃,同時加入一抗,培育12 h。之后進行次數(shù)為3次的洗滌,該過程所需的試劑為PBS且其含有0.1% Tween 20。再與室溫25℃的環(huán)境下,用酶標二抗培育樣本1 h,反復(fù)3次洗滌,再用印跡蛋白ECL成像系統(tǒng),成像曝光。免疫沉淀試驗用上述裂解緩沖液在無SDS的情況下裂解細胞,用1～2 μg抗體孵育過夜。然后樣品與10 μl蛋白A/G在4℃下孵育5 h,將相關(guān)蛋白分解進行Western blot。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染在下面網(wǎng)站中輸入鼠YAP核酸編碼序列設(shè)計shRNA:https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do,Target Design Options,將shRNA序列包含莖環(huán)和BamHI,HindIII酶切位點5’-GATCC GGAAG CGCTG AGTTC CGAAA TTGTG CTTAT TTCGG AACTC AGCGC TTCCT TTTTA-3’克隆至pAV-U6-GFP載體上。表達鼠YAP蛋白質(zhì)粒則是以pll3.1質(zhì)粒為模板,將C端帶有Flag標簽的鼠YAP蛋白的基因編碼序列克隆至CMV啟動子后。質(zhì)粒-細胞轉(zhuǎn)染時通過根據(jù)相關(guān)理論調(diào)研,選擇HEK293細胞進行前期培養(yǎng),當細胞生長至50%～60%程度時,將質(zhì)粒(5 μg)與PEI(1 mg/ml)(10 μl)共同混合搖勻,同時將DMEM培養(yǎng)基(200 μl)加入,培養(yǎng)細胞15 min,將以上的混勻物加入皿(35 cm)的HEK293細胞,進行12 h的培養(yǎng),培養(yǎng)后再更換培養(yǎng)基。

1.7 統(tǒng)計學分析選用SPSS25.0,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析,組間顯著性差異分析選非配對t檢驗和單因素方差分析。P<0.05時,為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP敲低shRNA的構(gòu)建

與scramble shRNA組相比,YAP水平在shYAP組中明顯下降78%,證實YAP shRNA敲低效率的同時說明其構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 YAPshRNA構(gòu)建的成果

2.2 肌管形成后敲低YAP抑制乙酰膽堿受體(AChR)聚集

在YAP敲低后AChR的長度和熒光強度都下降了約50%,肌管形成已經(jīng)完成后YAP功能的缺失會妨礙AChR的聚集,抑制神經(jīng)肌肉接頭的形成(圖2)。

圖2 肌管形成后YAP敲低的AChR聚集受損

2.3 agrin促進C2C12肌管中的YAP進入細胞核

免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)agrin加入1 h后就有較多的YAP進入細胞核并于3 h后達到最高,即75.4%的細胞核中有YAP,而且YAP進入細胞核要早于AChR的聚集(圖3)。

圖3 Agrin處理增強C2C12肌管中YAP核定位

2.4 agrin減弱YAP蛋白S127位的磷酸化

agrin處理后YAP磷酸化水平下降直至12 h,YAP-β-catenin結(jié)合升高之后下降,說明YAP對于突觸前后的調(diào)節(jié)有不同的機制(圖4)。

圖4 通過agrin處理降低YAP磷酸化

3 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)agrin通過減弱YAP蛋白磷酸化使YAP進入細胞核發(fā)生轉(zhuǎn)錄進而導致乙酰膽堿受體聚集從而有利于神經(jīng)肌肉接頭間信號的傳遞。神經(jīng)-肌肉接頭間生理信息傳導障礙會導致神經(jīng)-肌肉接頭疾病。目前已有研究者將谷氨酸能神經(jīng)-肌肉接頭(果蠅)認作一種經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ陀脕韺ν挥|相關(guān)活動的機制進行研究。部分學者認為氨基酸轉(zhuǎn)運體JhI-21及c-AMP對谷氨酸受體具有調(diào)控作用。前期文獻研究提供了一種假設(shè)即某一蛋白或許具有這樣的作用,通過聚集或抑制突觸受體進而影響神經(jīng)-肌肉接頭的形成。當興奮傳遞至突觸前膜時,ACh在Ca2+的輔助下,通過間隙到達突觸后膜并與其上的受體結(jié)合完成信號傳遞?；谏鲜?實驗中通過對YAP敲低后AChR的長度和熒光強度進行檢測,顯示出敲低YAP可以引起乙酰膽堿受體聚集減少,后續(xù)可以繼續(xù)探究與神經(jīng)-肌肉接頭形成相關(guān)的其他物質(zhì),進一步在其他層面進行多方面驗證。

通過近十年對NMJ的相關(guān)實驗研究,已形成蒼蠅和隱桿秀麗線蟲中NMJ的形成與Wnt信號具有關(guān)聯(lián)性的共識。NMJ在哺乳動物中的形成是否具有相同調(diào)節(jié)方式,對此尚無明確結(jié)論,部分學者提出Wnt通路成員與AChR的表達存在某種程度的相關(guān)性這一觀點,Wnt4和Wnt11的表達可以增加AChR的集中和運動神經(jīng)細胞的增殖從而促進哺乳動物神經(jīng)肌肉接頭的活性[19]。Wnt3a通過下調(diào)AChR聚集和穩(wěn)定所必需的Rapsyn蛋白進而拮抗AChR的聚集[20]。以上研究證明哺乳動物NMJ的形成過程有Wnt信號參與,但其具體的作用機制仍不明確。Hippo信號通路和Wnt信號通路存在重合點。Wnt通路受到Hippo通路影響的原因是后者導致自由細胞質(zhì)β-catenin低表達,在此情況下出現(xiàn)細胞周期停滯[21]。綜上所述,Wnt信號通路與Hippo信號通路存在交叉并參與NMJ的形成過程,因此推斷激動Hippo通路基因轉(zhuǎn)錄翻譯能力的YAP對NMJ的形成可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。以上推理論斷均與本實驗中YAP的作用存在一致性。接下來可以進行相關(guān)的細胞和動物實驗,進一步驗證本實驗的結(jié)果。

NMJ目前已成為經(jīng)典的神經(jīng)-化學突觸模型,近幾年來,對NMJ的構(gòu)成及其作用原理等進行的研究已經(jīng)逐漸深入。本實驗從YAP是否可以獨立對NMJ進行調(diào)控角度出發(fā),利用細胞免疫熒光染色,Western blot等方法,對NMJ調(diào)控機制進行研究,在研究過程中發(fā)現(xiàn)agrin信號通路可以減弱YAP磷酸化,促進YAP進入細胞核進而對突觸后 AChR 進行表達調(diào)控。目前對于 YAP 影響NMJ形成機制的研究仍處于萌芽階段。未來需要進行更多的相關(guān)研究,提供更多的有效數(shù)據(jù)。