RhD陰性孕婦DEL型的篩查及基因型分析

韓 雪,韓紅梅,李 捷

(天津市第五中心醫(yī)院 輸血科,天津300450)

在人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中,Rh血型系統(tǒng)的重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)。D抗原在Rh血型抗原中免疫原性最強(qiáng),抗-D可引起新生兒溶血病以及嚴(yán)重溶血性輸血反應(yīng)。D抗原存在多種變異體,包括部分D型(partial D)、弱D(week D)型、DEL型等。其中DEL型紅細(xì)胞膜上的D抗原表位數(shù)目較少,臨床上常規(guī)的血清學(xué)方法檢測(cè)通常判讀為陰性,需采用敏感的吸收放散試驗(yàn)檢出。目前已有RhD陰性孕婦被DEL型胎兒紅細(xì)胞免疫和RhD陰性個(gè)體輸注DEL型血液,而產(chǎn)生抗體的報(bào)道[1]。本研究旨在對(duì)天津?yàn)I海新區(qū)RhD初篩陰性的孕婦進(jìn)行DEL型基因分析,結(jié)合血清型抗原檢測(cè)和不規(guī)則抗體篩查,為DEL型孕婦提供合理的產(chǎn)前監(jiān)測(cè)計(jì)劃。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集天津市第五中心醫(yī)院產(chǎn)科就診的RhD陰性圍產(chǎn)期婦女標(biāo)本102例,年齡范圍20～39歲,平均年齡(28.72±7.65)歲,留取EDTA-K2抗凝全血約5 ml備用。納入標(biāo)準(zhǔn):產(chǎn)前RhD檢測(cè)結(jié)果為陰性且均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn):①異位妊娠者;②孕期合并有子宮內(nèi)膜疾病、既往有血液、免疫系統(tǒng)疾病史的患者或臨床資料不完整者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)可。

1.2 儀器與試劑

TD-3A型血型血清學(xué)離心機(jī)(長(zhǎng)春博訊科研儀器有限責(zé)任公司)移液器(Eppendrof公司)。核酸提取或純化試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)201808001);人類紅細(xì)胞RHD基因分型試劑盒(PCR-SSP法)(天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)201810002);瓊脂糖(Biowest)EB染料(天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)201703001);高速離心機(jī)(SIGMA SIGMA1-14);JY300C電泳儀(北京君意東方電泳有限公司);PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司9700型);GenoSens1860凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡(單克隆抗體)(生產(chǎn)批號(hào)20161204,20171204,20181204,長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司);ABO正反定型及RhD血型定型試劑卡(柱凝集法)(生產(chǎn)批號(hào)ABR261A,ABR268A,奧森多醫(yī)療器械貿(mào)易(中國(guó))有限公司);RhD(IgG)血型定型試劑(單克隆抗體)(生產(chǎn)批號(hào)20181809,上海血液生物);Rh血型抗原檢測(cè)卡(單克隆抗體)(生產(chǎn)批號(hào)20160601,20170601,20180601,長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司);抗人球蛋白微柱凝膠檢測(cè)卡(生產(chǎn)批號(hào)20161103,長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司);抗篩細(xì)胞(生產(chǎn)批號(hào)45330.19.1,美國(guó)伯樂(lè));酸放散液(廣州展全公司、生產(chǎn)批號(hào):20170101)。

1.3 方法

1.3.1RhD陰性血清學(xué)確認(rèn)檢測(cè) ①試管法:取不同批號(hào)的IgM、IgG抗-D2滴與3%～5%待檢紅細(xì)胞懸液50 μl混勻,37℃水浴60 min,再以大量生理鹽水洗滌3次,棄去上清液,加入抗球蛋白試劑2滴混勻,1 000 g離心15 s,不凝集即確定為RhD陰性。②微柱凝膠法:取RhD血型檢測(cè)卡,加入0.8%～1%待檢懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本50 μl混勻,置專用離心機(jī)214 g離心5 min后取出,觀察不凝集即判定為RhD陰性。

1.3.2放散D(DEL型)檢測(cè)方法 生理鹽水洗滌待檢紅細(xì)胞3次,取1 ml紅細(xì)胞標(biāo)本與IgG抗D混勻,37℃水浴60 min進(jìn)行吸收實(shí)驗(yàn),然后進(jìn)行酸放散,如吸收放散試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)表明為DEL型。

1.3.3Rh抗原血清學(xué)檢測(cè) Rh血型抗原檢測(cè)卡每孔加入1%待檢紅細(xì)胞懸液50 μl,離心后,根據(jù)待檢紅細(xì)胞與檢測(cè)卡RhC、c、D、E、e單克隆抗體反應(yīng)格局,判讀Rh血型表型結(jié)果。

1.3.4基因組DNA的提取 嚴(yán)格按照天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,提取104例經(jīng)抗人球蛋白法確定為RhD陰性的樣本提取基因組DNA備用。DNA產(chǎn)物應(yīng)該保存在-20℃,以防NDA降解。

1.3.5PCR檢測(cè) 根據(jù)《人類紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒(PCR-SSP法)》說(shuō)明書(shū),在ABI9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行試驗(yàn)操作,操作步驟如下:將80 μl dNTP-Buffer工作液、0.8 μl Taq酶和10 μl DNA總共90.8 μl混合液漩渦混勻并瞬時(shí)離心;向每個(gè)引物孔(1～8孔)各加入10 μl上述混合液。PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 2 min,1個(gè)循環(huán);96℃ 20 s,68℃ 60 s,5個(gè)循環(huán);96℃ 20 s,65℃ 50 s,72℃ 45 s,10個(gè)循環(huán);96℃ 20 s,62℃ 50 s,72℃ 45 s,18個(gè)循環(huán);72℃ 5 min,1個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物移至2.5%瓊脂糖凝膠電泳孔中,電泳參數(shù)設(shè)置為140-150V電泳15～20 min,電泳后紫外光下成像儀拍照記錄及分析。根據(jù)提供的結(jié)果分型表(表1)解釋分型結(jié)果。

表1 RHD基因分型結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)確認(rèn)試驗(yàn)經(jīng)檢測(cè)102例標(biāo)本均鑒定為RhD陰性,吸收放散試驗(yàn)結(jié)果顯示15例DEL表現(xiàn)型(占14.7%)。

2.2 不規(guī)則抗體篩查檢出9例陽(yáng)性,其抗體為抗-D,基因分型均為RhD全缺失型。15例DEL型孕婦均未檢測(cè)到抗-D抗體。孕婦血清抗-D抗體與妊娠或生產(chǎn)的關(guān)系,見(jiàn)表2。

表2 孕婦血清抗-D抗體與妊娠或生產(chǎn)的關(guān)系

2.3 Rh血型系統(tǒng)抗原檢測(cè)102份陰性標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)CCEe、CcEE 及CCEE表型(表3)。

表3 RhD初篩陰性孕產(chǎn)婦標(biāo)本Rh血型系統(tǒng)分型結(jié)果

2.4 102例RhD陰性圍產(chǎn)期婦女標(biāo)本RHD基因分型RHD基因全缺失型70例,占全部陰性標(biāo)本的68.6%;DEL RHD 1227A型標(biāo)本15例,占全部陰性標(biāo)本的14.7%,其中純合型13例,雜合型2例;RHD-CE(2-9)-D標(biāo)本10例,占全部陰性標(biāo)本的9.8%;弱D15型標(biāo)本5例,占全部陰性標(biāo)本的4.9%;另外有2例不能用此PCR-SSP試劑盒確定其基因型,占全部標(biāo)本的2%,見(jiàn)圖1～6,表4。圖1-6為RHD基因分型PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的條帶格局。

圖1 RHD基因全缺失型 圖2 DEL RHD1227A純合型

圖3 RHD-CE(2-9)-D型 圖4 弱D15型

圖5 DEL RHD1227A雜合型 圖6 不能定型

表4 102例RhD初篩陰性圍產(chǎn)期婦女標(biāo)本RHD基因分型結(jié)果

2.5 102例不同D表現(xiàn)型在RhCE表型中的分布

見(jiàn)表5。

表5 102例不同D表現(xiàn)型在RhCE表型中的分布(n,%)

3 討論

從臨床角度來(lái)看,D抗原在Rh系統(tǒng)的54種血型抗原中是最具免疫原性和重要性的。RhD陰性孕婦產(chǎn)生抗-D的后果是任何涉及RhD陽(yáng)性胎兒的后續(xù)妊娠都具有新生兒溶血病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。DEL型表達(dá)較弱的的D抗原,在不同地區(qū)中的遺傳頻率差異較大。DEL型在亞洲Rh陰性個(gè)體中占有較高比例,在日本RhD初篩陰性個(gè)體中DEL型占28%[2],國(guó)內(nèi)報(bào)道為15.5%～29.95%[3-5]。本研究采用吸收放散試驗(yàn)和PCR-SSP法檢出DEL RHD1227A型15例,占14.7%。其中純合型13例,另外2例為弱D15與DEL RhD1227A雜合型,說(shuō)明DEL型的分布存在一定的地區(qū)差異。其血清表型分別為Ccee、CCee及CcEe,推測(cè)1227A可能與C抗原相關(guān),與國(guó)內(nèi)報(bào)道稱DEL中RhC(+)近100%[6]的理論相符,但是否可通過(guò)C抗原與DEL型之間的相關(guān)性來(lái)確定檢測(cè)方法還需要進(jìn)一步研究。中國(guó)漢族人群的研究資料表明,DEL型主要由RHD1227A等位基因編碼組成[7]。1227A因其位于第9外顯子最后一位,影響了mRNA的正常連接形成了短的mRNA,從而降低了RHD基因的表達(dá)效率,造成了紅細(xì)胞膜上的D抗原分子數(shù)量明顯減少。而有關(guān)研究提示編碼RhD 1227A等位基因的DEL個(gè)體具有完整的D抗原表位[8],如果DEL型表達(dá)完整的D抗原,DEL個(gè)體將可能不會(huì)被D抗原免疫產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

本研究對(duì)102例Rh陰性孕婦進(jìn)行了不規(guī)則抗體篩查,有9例產(chǎn)生了抗-D(8.8%),其基因型均為RHD全缺失型,血清表型均為ccee。在真實(shí)RhD陰性產(chǎn)婦產(chǎn)生抗-D抗體的比例為12.9%(9/70),其中無(wú)妊娠史者4例,生育史大于等于2次有5例。本研究中未發(fā)現(xiàn)DEL型孕婦產(chǎn)生抗-D抗體,其中包括有多次孕產(chǎn)史的案例,提示DEL型女性妊娠時(shí)可能不被D抗原致敏而產(chǎn)生同種免疫反應(yīng),與以往研究相符[9-10]。建議臨床醫(yī)生對(duì)此種類型孕婦不需要進(jìn)行繁雜的抗體檢測(cè)和預(yù)防注射Rh免疫球蛋白,可避免注射免疫球蛋白產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)和經(jīng)濟(jì)壓力,同時(shí)也可保存有限的RhD陰性紅細(xì)胞供應(yīng)。由此可見(jiàn),結(jié)合血清學(xué)檢查、吸收放散法和RHD基因分型,更能準(zhǔn)確的確認(rèn)產(chǎn)婦RhD血型,有助于指導(dǎo)臨床為RhD陰性產(chǎn)婦制定合理的抗體監(jiān)測(cè)及注射免疫球蛋白相關(guān)的預(yù)防策略。對(duì)RhD陰性孕產(chǎn)婦二次妊娠及新生兒溶血病的及時(shí)預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)102例RhD陰性標(biāo)本的血型抗原分型中以ccee(56%)和Ccee(28.4%)頻率最高?；蚍中椭蠷HD全缺失型70例,占全部標(biāo)本的68.6%,其Rh表型主要是ccee(78.6%),說(shuō)明RHD全缺失型與ccee表型高度關(guān)聯(lián)。另外,本研究中還發(fā)現(xiàn)10例部分D變異體RHD-CE(2-9)-D型,分別在表型Ccee、ccEe中檢出。RHD-CE(2-9)-D型在部分D中最常見(jiàn),其分子機(jī)制是第2～9外顯子與相應(yīng)的RHCE基因產(chǎn)生替換,只能表達(dá)部分D抗原。由于氨基酸替換主要發(fā)生在胞外區(qū),所以容易刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。目前國(guó)內(nèi)已有報(bào)道顯示[11]RHD-CE(2-9)-D型個(gè)體被D抗原致敏產(chǎn)生抗-D抗體,所以該類孕婦需要在整個(gè)孕期監(jiān)測(cè)抗-D抗體以及預(yù)防注射免疫球蛋白。中國(guó)人群中弱D變異體最常見(jiàn)的有弱D15型和弱D12型,本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出5例弱D15型,血清分型分別是Ccee(60%)和CcEe(40%)。弱D表型分子機(jī)制已被廣泛報(bào)道[12],由于跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)發(fā)生了氨基酸替換,可能影響紅細(xì)胞膜的表達(dá),導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上的抗原數(shù)量減少,而抗原表位不變。如果弱D型供血者的紅細(xì)胞輸注給了Rh陰性患者,可刺激機(jī)體產(chǎn)生同種免疫,產(chǎn)生抗D抗體而引起嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)[13]。

綜上所述,對(duì)于初篩為RhD陰性的孕婦,建議通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)合RHD基因分型試驗(yàn)進(jìn)行DEL型表型和基因型鑒定,根據(jù)RhD基因型將其管理為RhD陽(yáng)性或RhD陰性來(lái)制定整個(gè)孕期的管理辦法。研究RHD基因的變異,對(duì)人類輸血安全和新生兒溶血病的防御具有重要意義。