子宮內(nèi)膜類器官-體外研究子宮內(nèi)膜的新工具

徐 玲，程邵龍 綜述 劉堯芳 審校

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（瀘州 646000）

女性的每個(gè)月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜在激素的作用下發(fā)生增殖期、分泌期、月經(jīng)期的周期性變化，不同階段內(nèi)膜的組織學(xué)、代謝以及基因組學(xué)等特征均存在差異，不同個(gè)體間也具有一定的異質(zhì)性。內(nèi)膜是胚胎著床并正常發(fā)育的土壤，內(nèi)膜異常會(huì)增加不孕癥、胚胎反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和胎盤異常的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生[1-4]。由于子宮內(nèi)膜具有高度的動(dòng)態(tài)性、異質(zhì)性、與臨床疾病具有高度的關(guān)聯(lián)性以及涉及倫理問題等，對(duì)其生理變化以及相關(guān)疾病的病理過程的研究具有極大挑戰(zhàn)。

類器官是利用3D 培養(yǎng)技術(shù)，將來源于人類或動(dòng)物組織的具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞包被于人工基質(zhì)膠中進(jìn)行培養(yǎng)，形成的培養(yǎng)物可真實(shí)地反映起源組織的結(jié)構(gòu)和功能，具有生理反應(yīng)性、相對(duì)穩(wěn)定的表型及遺傳學(xué)特征[5]。類器官能夠用于研究器官的正常發(fā)育、疾病的模擬、藥物效果的預(yù)測等，并為個(gè)性化再生醫(yī)學(xué)開辟了新途徑[6-8]。人子宮內(nèi)膜類器官目前已受到廣泛關(guān)注和重視，現(xiàn)已應(yīng)用于研究子宮內(nèi)膜正常周期的生理變化、胚胎植入的分子機(jī)制，以及子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌和其他婦科疾病的病理性子宮內(nèi)膜功能障礙等[9-13]。本文就子宮內(nèi)膜類器官的應(yīng)用進(jìn)展做一綜述（見圖1）。

圖1 子宮內(nèi)膜類器官的應(yīng)用研究Figure 1 Study on the application of endometrial analogue organs

1 子宮內(nèi)膜類器官用于宮腔微環(huán)境

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞有分泌功能，尤其是分泌期會(huì)轉(zhuǎn)化為高度分泌狀態(tài)，將生長因子、蛋白酶、葡萄糖、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等物質(zhì)釋放入子宮腔[14-16]，對(duì)精子遷移、胚胎著床及妊娠的維持等起著重要作用。宮腔內(nèi)微環(huán)境的成分異常，可能影響女性的受孕機(jī)會(huì)，增加不孕癥、胚胎反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。2003 年VAN DER GAAST MH等[17]首次提出通過分析宮腔微環(huán)境來評(píng)估細(xì)胞因子情況。隨后，其他學(xué)者陸續(xù)展開對(duì)宮腔微環(huán)境的分析，并發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)的腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1 等細(xì)胞因子可作為預(yù)測妊娠結(jié)局的重要指標(biāo)[18-20]。由此可見，宮腔微環(huán)境的分析具有重要的臨床意義。

臨床上，宮腔分泌物的獲得方法有抽吸、宮腔灌注等，操作過程中抽吸管需要經(jīng)過宮頸管到達(dá)宮腔，此類方法會(huì)受到宮頸管分泌物的干擾，存在技術(shù)局限性[21]。子宮內(nèi)膜類器官用于宮腔分泌物的分析是研究方式的一種轉(zhuǎn)變[22]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜類器官存在極性，基底外側(cè)面朝外，頂端細(xì)胞膜向內(nèi)（面向類器官的中心）[8，23]，這表明類器官可能是體外研究宮腔分泌物形成和功能的有用模型。根據(jù)類器官與液體的相對(duì)位置，分為類器官外液、類器官內(nèi)液，采用代謝組學(xué)等方法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外液、內(nèi)液中均存在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3 和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白10 等，其中僅內(nèi)液檢測出尿苷5'-二磷酸-N-乙酰氨基葡糖，并且內(nèi)液中葡萄糖含量顯著降低[24]。類器官內(nèi)液、外液間的這種差異，可能將為分析宮腔微環(huán)境成分提供好的依據(jù)，并有助于建立與妊娠成功有關(guān)的分泌物圖譜。

2 子宮內(nèi)膜類器官用于子宮內(nèi)膜周期性變化

女性的每個(gè)月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜增生、修復(fù)和重塑，為胚胎著床做好準(zhǔn)備；如果沒有妊娠，子宮內(nèi)膜會(huì)脫落，形成月經(jīng)。子宮內(nèi)膜類器官在雌激素、孕激素作用下可模擬月經(jīng)周期的變化。

子宮內(nèi)膜類器官經(jīng)過雌二醇處理后，Ki67+細(xì)胞、雌二醇受體和孕酮受體陽性細(xì)胞數(shù)量均增加[23]；類器官細(xì)胞上存在纖毛細(xì)胞，雌二醇處理后，纖毛上皮細(xì)胞和無纖毛上皮細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加[5，10，23，25]。對(duì)細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn)，類器官中微小染色體維持蛋白2、微小染色體維持蛋白3 和Indian hedgehog 等的表達(dá)經(jīng)過雌二醇處理后均上調(diào)，增殖期特異性標(biāo)記物促甲狀腺素釋放激素表達(dá)也增加[10，23，26]。這些變化均類似于體內(nèi)增殖期子宮內(nèi)膜的變化[27]。由此認(rèn)為，子宮內(nèi)膜類器官是研究雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮形態(tài)發(fā)生和功能影響的良好體外模型。

子宮內(nèi)膜類器官續(xù)貫應(yīng)用孕激素處理后，發(fā)生類似于分泌期子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)變化，增殖細(xì)胞數(shù)量減少，腺體折疊和彎曲增加，柱狀細(xì)胞顯示亞核空泡[10，23]。雌激素受體和孕酮受體的表達(dá)顯著降低，乙?；?微管蛋白、粘蛋白等表達(dá)均上調(diào)，而這些分子均是體內(nèi)分泌期子宮內(nèi)膜的標(biāo)記物[28-30]。已知在分泌中期雌二醇和孕酮上調(diào)的基因17 β-羥甾類固醇脫氫酶、白血病抑制因子、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4等，類器官中經(jīng)過雌二醇、孕酮處理后均上調(diào)，也與體內(nèi)一致[5，31]。子宮內(nèi)膜類器官經(jīng)孕酮處理后的這些變化重現(xiàn)了體內(nèi)分泌期子宮內(nèi)膜特點(diǎn)[5，23，27，32]，由此推測，子宮內(nèi)膜類器官為研究孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜的影響也提供了一個(gè)合適的體外模型。

BORETTO M 等[23]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜類器官停止雌激素刺激后（激素戒斷），腺體結(jié)構(gòu)破壞，類器官變暗，出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，類似于體內(nèi)子宮內(nèi)膜激素撤退以后的變化。

綜上所述，子宮內(nèi)膜類器官在雌激素、孕激素作用下，可以重現(xiàn)體內(nèi)子宮內(nèi)膜增殖期、分泌期及月經(jīng)期的相關(guān)變化，重現(xiàn)周期特異性細(xì)胞組成變化及細(xì)胞因子改變特征，可能將成為研究調(diào)節(jié)人類子宮內(nèi)膜分化機(jī)制及病理學(xué)改變的強(qiáng)大平臺(tái)。

3 子宮內(nèi)膜類器官用于子宮內(nèi)膜容受性及胚胎與子宮內(nèi)膜的對(duì)話

子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜在種植窗期接受胚胎的能力，即允許受精卵定位、黏附、侵入并使子宮內(nèi)膜發(fā)生一系列改變從而植入子宮內(nèi)膜的一種能力。容受性的建立受到高度調(diào)節(jié)，涉及子宮內(nèi)膜上皮以及基質(zhì)的變化，體內(nèi)研究目前受到倫理限制。類器官能讓我們克服倫理的限制，可在體外/離體狀態(tài)研究子宮內(nèi)膜容受性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜類器官表達(dá)雌激素受體、基質(zhì)金屬蛋白酶26 和Glycodelin A（GdA），其中雌激素受體在促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖方面具有重要的作用，基質(zhì)金屬蛋白酶26在種植窗期參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑[33-34]，GdA 被認(rèn)為是分子水平上調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的最有價(jià)值的標(biāo)記物之一[35]；類器官經(jīng)過雌激素、孕激素處理后這三種因子均發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[36]，提示使用類器官分析人子宮內(nèi)膜容受性具有科學(xué)依據(jù)。子宮內(nèi)膜類器官還表達(dá)分泌因子的基因及蛋白，如血管內(nèi)皮生長因子A、白細(xì)胞介素15 和金屬肽酶抑制劑等[37-39]。類器官的這些特征為研究子宮內(nèi)膜容受性提供了一個(gè)好的體外模型。

為了研究胚胎植入過程中胚胎與子宮內(nèi)膜的對(duì)話，BENTIN-LEY U 等[40]將原代人胚胎干細(xì)胞嵌入膠原和基質(zhì)中，在基質(zhì)凝膠下植入上皮腺體，將人類囊胚置于頂部。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間橋粒形成，滋養(yǎng)層細(xì)胞通過產(chǎn)生突起結(jié)構(gòu)侵入子宮內(nèi)膜組織。此項(xiàng)研究證實(shí)體外系統(tǒng)模擬胚胎植入過程是可能的。隨后一項(xiàng)研究在Matrigel 支架中嵌入Ishikawa、HEC-1-A 和RL95-2 細(xì)胞模擬腺上皮，觀察到細(xì)胞自發(fā)分化為腺體樣球體，具有不同程度的頂-基極化和清晰的管腔；使用滋養(yǎng)層細(xì)胞系（AC-1M88）生成的球體與這些腺體樣球體的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞侵入更強(qiáng)[41]。2019年一項(xiàng)研究將人胚胎干細(xì)胞鍍在單層中，并在其頂部添加基質(zhì)凝膠以生成細(xì)胞外基質(zhì)，也觀察到基質(zhì)凝膠頂部的滋養(yǎng)層球體向ESC 細(xì)胞遷移并侵入基質(zhì)[42]。

隨著研究的深入，類器官可能用于有效地篩選控制胚胎著床和子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等，并且可能發(fā)現(xiàn)與著床、子宮內(nèi)膜容受性異常相關(guān)疾病如不孕癥、胚胎反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療干預(yù)措施[43]。

4 子宮內(nèi)膜類器官用于子宮內(nèi)膜異位癥

子宮內(nèi)膜異位癥是一種以子宮內(nèi)膜組織異位生長為特征的疾病，病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有效的治療方法有限。子宮內(nèi)膜類器官的建立和應(yīng)用可能有助于研究子宮內(nèi)膜異位癥的確切發(fā)病機(jī)制。來自病人的在位和異位子宮內(nèi)膜均可以建立類器官[13，44]。異位子宮內(nèi)膜類器官與在位子宮內(nèi)膜類器官一樣，含有帶有纖毛的極化分泌上皮細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞角蛋白7、雌激素受體和孕酮受體等。異位子宮內(nèi)膜類器官也有異質(zhì)性疾病特征，包括整合素、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路的異常，糖蛋白分泌存在差異等[9，13]；研究還發(fā)現(xiàn)，IV期子宮內(nèi)膜異位癥衍生的類器官具有子宮內(nèi)膜癌基因相關(guān)突變，表明癌癥驅(qū)動(dòng)基因參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展[9]。這些特點(diǎn)為研究子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)孕酮抵抗的分子機(jī)制提供了臨床前模型，為確定潛在的藥物靶點(diǎn)提供了新思路[45]。

5 子宮內(nèi)膜類器官是研究子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)特平臺(tái)

子宮內(nèi)膜癌起源于子宮內(nèi)膜腺上皮，是女性常見的惡性腫瘤，其治療需要基于細(xì)胞的分子和/或基因組成的個(gè)體化治療。子宮內(nèi)膜癌類器官有望作為一種準(zhǔn)確再現(xiàn)癌變細(xì)胞行為的體外模型。TURCO、GIRDA 等相繼報(bào)道了子宮內(nèi)膜癌類器官的建立和研究[5，13，46]，目前已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。

子宮內(nèi)膜癌類器官可以來源于不同分化程度的原發(fā)腫瘤，并且來自于不同級(jí)別的子宮內(nèi)膜癌類器官具有不同的特點(diǎn)，來自低級(jí)別者表現(xiàn)出腺體樣形態(tài)，具有明確的管腔；來自高級(jí)別者通常缺乏管腔[13]。來源于子宮內(nèi)膜癌病人的類器官可再現(xiàn)原發(fā)腫瘤的形態(tài)，并顯示出與原發(fā)腫瘤相似的免疫組織化學(xué)特征[47]，長期擴(kuò)張后保留了原發(fā)性腫瘤中的大多數(shù)基因變化，并且可重現(xiàn)體內(nèi)疾病的表型。子宮內(nèi)膜癌類器官表達(dá)附膜蛋白1和SOX17[5，46]（提示其腺體來源），部分表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制有關(guān)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[13]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)皮下注射子宮內(nèi)膜癌類器官能形成細(xì)胞團(tuán)，重現(xiàn)了原發(fā)腫瘤的組織學(xué)和分子特征。將子宮內(nèi)膜癌類器官原位植入子宮角也生成了具有浸潤性的、高度增殖的腫塊[13]。

應(yīng)用子宮內(nèi)膜癌類器官可以進(jìn)行藥物篩選[47]。子宮內(nèi)膜癌類器官模型上測試維替泊芬的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維替泊芬可以誘導(dǎo)類器官細(xì)胞凋亡和抑制信號(hào)通路。使用最新靶向藥物的綜合文庫對(duì)子宮內(nèi)膜癌類器官進(jìn)行高通量藥物篩選，報(bào)道顯示與其他聯(lián)合治療策略相比，對(duì)于子宮內(nèi)膜腺癌類器官，布帕立西和伏立諾他?。℉DAC 抑制劑）的聯(lián)合治療是最有效的治療方法[48]。

總的來說，子宮內(nèi)膜癌類器官將為研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展提供一種好的方法，為研究其內(nèi)分泌特征、藥物敏感性等提供一個(gè)獨(dú)特的模型[9.49]。

6 子宮內(nèi)膜類器官用于多囊卵巢綜合征及感染性疾病

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是常見的女性代謝及生殖障礙性疾病，其特征是雄激素水平升高、無排卵和不孕[50-51]。異常的內(nèi)分泌狀態(tài)會(huì)對(duì)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低或者過度增生等[52-54]，但其具體的分子或基因改變因尚無合適的體外模型而缺乏較全面的認(rèn)識(shí)。目前已有分析PCOS 激素狀態(tài)下子宮內(nèi)膜變化的類器官模型的報(bào)道。WIWATPANIT T等[55]建立了子宮內(nèi)膜類器官，模擬PCOS激素變化作用14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，類器官的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖增加，約為正常激素狀態(tài)下的3 倍；與正常類器官相比，PCOS 類器官中約有95 個(gè)基因受到差異調(diào)節(jié)。由此推測，子宮內(nèi)膜類器官可能將為研究PCOS的子宮內(nèi)膜變化提供平臺(tái)。

感染對(duì)子宮內(nèi)膜影響的研究也因缺乏模型而難以全面分析。為了分析感染對(duì)子宮內(nèi)膜的影響，DOLAT L等[56]建立子宮內(nèi)膜類器官，并觀察了衣原體感染后子宮內(nèi)膜類器官細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的定位變化。隨后認(rèn)為子宮內(nèi)膜類器官適用于篩選沙眼衣原體突變株，并可以應(yīng)用于研究衣原體感染的細(xì)胞生物學(xué)變化。

7 小結(jié)與啟示

子宮內(nèi)膜類器官的研究和應(yīng)用已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。但目前仍存在一定局限性：①目前標(biāo)本均來源于病人，這會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果存在異質(zhì)性；②類器官中的細(xì)胞目前報(bào)道多為上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，與體內(nèi)子宮內(nèi)膜的多細(xì)胞狀態(tài)存在很大的距離。子宮內(nèi)膜類器官的進(jìn)一步完善，將為研究子宮內(nèi)膜生理學(xué)及病理學(xué)變化提供一個(gè)強(qiáng)大的體外模型，為明確子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病如胚胎反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎盤相關(guān)疾病等的病理機(jī)制研究開辟了新的道路，為藥物篩選、再生醫(yī)學(xué)等提供理想的生物庫。