IRS1基因rs7578326位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病合并高甘油三酯關(guān)聯(lián)研究

武志鳳，金 花，吳英博，劉玉嬌，韓立坤，白?；?/p>

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)個(gè)體化用藥工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的代謝性慢性疾病，其中，以2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占比最大，且患病率逐年增加[1］。據(jù)相關(guān)研究表明，T2DM主要由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起，其主要特征是胰島素抵抗[2-3］。血脂的升高將進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生，致使T2DM合并高甘油三酯的風(fēng)險(xiǎn)提高。血脂異常一般表現(xiàn)為總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Tri?glycerides，TG）及低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的升高和（或）高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的降低等[4］。T2DM在遺傳方面存在種族異質(zhì)性，其發(fā)病率存在明顯差異[5］。在被胰島素刺激的肝瘤細(xì)胞漿的研究中發(fā)現(xiàn)IRS1基因是分子量為185 kDa親水性蛋白，現(xiàn)已成功得到克隆[6-7］。IRS1基因產(chǎn)物主要分布在胰島素外周組織和器官中，在調(diào)節(jié)胰島素信號通路中有6個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（Tyr-Met-X-Met）起關(guān)鍵作用[8-9］。單核苷酸多態(tài)性與T2DM的遺傳易感性已被大多數(shù)的試驗(yàn)所證實(shí)[10］。據(jù)先前候選基因測序的研究中發(fā)現(xiàn)，在蒙古族T2DM人群中IRS1基因存在獨(dú)特的多態(tài)性位點(diǎn)，即IRS1rs7578326位點(diǎn)[11］。目前，對蒙古族IRS1基因多態(tài)性與2型糖尿病合并高甘油三酯的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。筆者通過本研究試圖分析并進(jìn)一步驗(yàn)證IRS1rs7578326位點(diǎn)與蒙古族患者2型糖尿病合并高甘油三酯的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020年9月—2021年12月在內(nèi)蒙古東部地區(qū)地方醫(yī)院就診的71例蒙古族糖尿病患者作為病例組（T2DM組），包括男性26例，女性45例，平均年齡（53.83±10.83）歲。選取78例蒙古族無糖尿病、無高血脂的健康人群作為正常對照組（NC組），包括男性23例，女性55例，平均年齡（45.69±9.61）歲。選取95例蒙古族T2DM 合并高甘油三酯患者（T2DM+高TG 組），包括男性42 例，女性53 例，平均年齡（53.53±10.52）歲。選取93例蒙古族高甘油三酯患者，包括男性41例，女性52例，平均年齡（44.49±15.51）歲。以上4組均為蒙古族，且個(gè)體間沒有血緣關(guān)系。根據(jù)WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥7.0 mmol·L-1可診斷為T2DM；根據(jù)2016 年修訂版《中國成人血脂異常防治指南》中的高血脂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：甘油三酯（TG）≥1.70 mmol·L-1，并排除患有嚴(yán)重心、腎、肝等疾病的患者。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：按照年齡及性別進(jìn)行匹配，血脂7項(xiàng)+葡萄糖檢測無明顯異常者。入組對象均自愿參加本項(xiàng)研究并積極配合，并知情同意和簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 信息采集 使用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的流行病學(xué)調(diào)查問卷分別對4組人群進(jìn)行問卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括：一般人口學(xué)資料、飲酒史、飲食等生活習(xí)慣，個(gè)人史、家族史等；收集身高、體重、腰圍、血壓等基本人體指標(biāo)以及計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（Body mass index，BMI）=體重（kg）/[身高（m）］2。

1.2.2 提取基因組DNA 對所有研究對象均采集外周血5 mL，采用酚/氯仿法提取外周血基因組DNA。具體為，3 mL血液樣本倒入50 mL離心管中，加入10倍體積的蒸餾水，4 ℃5 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)2 次后加入生理鹽水20 mL，4 ℃下5 000 r·min-1離心10 min，用以破紅細(xì)胞，另外再加入TES 4 mL、10% SDS 300 μL 及蛋白酶K 100 μL，并過夜消化用以破白細(xì)胞，次日再用酚、氯仿抽提細(xì)胞總DNA，最后加入200 μL ddH2O用于保存所提取的DNA。隨后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與基因多態(tài)性檢測 用Primer5.0設(shè)計(jì)PCR引物（表1），將設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行BLAST檢測，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，含10×Taq PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mM dNTP 2.5 μL，上游引物、下游引物各2.0 μL，DNA 模板2.0 μL，0.5 μL 的Taq 酶以及ddH2O 36.0 μL。在普通PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：設(shè)置95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

表1 rs7578326擴(kuò)增片段序列Tab. 1 Amplified fragment sequence of rs7578326

PCR產(chǎn)物的檢測及基因多態(tài)性檢測：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（100~2 000 bp）標(biāo)準(zhǔn)物作為參照。目的條帶經(jīng)過純化用于Sanger 測序，進(jìn)行IRS1基因rs7578326位點(diǎn)的基因多態(tài)性檢測。

1.3 血脂生化指標(biāo)檢測

測定T2DM相關(guān)指標(biāo)，氧化酶法檢測（口服75 g葡萄糖）2 h 血漿葡萄糖濃度（2h-PG）：3.9~6.1 mmol·L-1?？偰懝檀迹═C）<5.6 mmol·L-1、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）：0.19~1.55 mmol·L-1、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）<3.12 mmol·L-1、甘油三酯（TG）<1.70 mmol·L-1，以上生化指標(biāo)檢測均由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。T2DM+高甘油三酯組、T2DM 組、高甘油三酯組、對照組與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，采用χ2檢驗(yàn)對基因型和等位基因頻率進(jìn)行比較分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示。組間差異比較使用單因素方差分析（ANOVA）、t檢驗(yàn)或協(xié)方差分析檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示。通過單因素Logistic回歸分析組間等位基因或基因型的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及生化指標(biāo)比較結(jié)果

選取蒙古族T2DM組71例、正常對照組78例、高甘油三酯組93例、T2DM+高甘油三酯組95例為研究對象，進(jìn)行一般資料及生化指標(biāo)比較。T2DM組和T2DM+高甘油三酯組研究對象的平均年齡高于正常對照組，TC、LDL-C的平均水平均高于正常對照組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T2DM+高甘油三酯組TC、TG的平均水平均高于T2DM組，HDL-C的平均水平低于T2DM組。T2DM+高甘油三酯組的平均年齡、TG、LDL-C的平均水平均高于高甘油三酯組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 4組一般資料及生化指標(biāo)比較（±s）Tab. 2 Comparison of general information and biochemical indexes of the four groups（±s）

表2 4組一般資料及生化指標(biāo)比較（±s）Tab. 2 Comparison of general information and biochemical indexes of the four groups（±s）

注：與NC 組比較*P<0.05；與T2DM 組比較#P<0.05；與高甘油三酯組比較▲P<0.05。BMI：體質(zhì)指數(shù)（body mass index）；SBP：收縮壓（systolic pressure）；DBP：舒張壓（diastolic pressure）；WC：腰圍（waistline）；TC：總膽固醇（total cholesterol）；TG：甘油三酯（triglyceride）；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol）；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol）。

DBP/mmHg 83.77±15.23*76.94±11.49 82.03±11.73*82.33±17.10*LDL-C/（mmol·L-1）2.78±1.47*▲2.31±0.58 2.34±0.56 2.70±0.82*▲組別T2DM組NC組高甘油三酯組T2DM+高TG組組別T2DM組NC組高甘油三酯組T2DM+高TG組例數(shù)/（男/女）71（26/45）78（23/55）93（41/52）95（42/53）WC/cm 88.66±11.27*▲84.12±9.55 99.43±10.20*90.80±11.36*▲年齡/歲53.83±10.83*▲45.69±9.61 44.49±15.51 53.53±10.52*▲TC/（mmol·L-1）4.31±0.85*3.99±0.63 4.53±0.55*4.62±0.76*#BMI/（kg·m-2）25.11±5.08 24.11±3.48 25.73±4.21*25.85±3.84*TG/（mmol·L-1）1.34±0.24▲1.21±0.26 2.78±1.30*3.13±1.66*#▲SBP/mmHg 140.11±26.32*121.31±19.37 133.34±23.41*136.54±25.93*HDL-C/（mmol·L-1）1.40±0.35*▲1.24±0.19 1.13±0.25*1.10±0.19*#

2.2 IRS1基因多態(tài)性檢測結(jié)果

2.2.1 基因組DNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

提取的基因組DNA（見圖1A），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段為345 bp（見圖1B）。質(zhì)檢結(jié)果較好。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Diagram of 1% agarose gel electrophoresis

2.2.2 PCR產(chǎn)物測序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，IRS1基因rs7578326位點(diǎn)基因型分為野生型AA，雜合突變型AG，純合突變型GG。測序結(jié)果見圖2。

圖2 IRS1基因rs7578326位點(diǎn)測序圖譜Fig. 2 Sequencing map of rs7578326 site of IRS1 gene

2.2.3IRS1基因rs7578326位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率比較

IRS1基因rs7578326位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率的組間比較：所有組別的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0.05）。IRS1基因rs7578326位點(diǎn)的等位基因?yàn)锳、G 。T2DM+高甘油三酯組rs7578326位點(diǎn)A等位基因頻率為85.8%，G等位基因頻率為14.2%，AA、AG和GG基因型頻率分別為75.8%、20.0%、4.2%；NC組A等位基因頻率為76.3%，G等位基因頻率為23.7%，AA、AG和GG基因型頻率分別為57.7%、37.2%、5.1%；高甘油三酯組A等位基因頻率為83.3%，G等位基因頻率為16.7%，AA、AG和GG基因型頻率分別為71.0%、25.0%、4.0%。與對照組相比，T2DM+高甘油三酯組和高甘油三酯組基因型頻率和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且A等位基因的頻率較NC組顯著升高（P<0.05）。T2DM組rs7578326位點(diǎn)A等位基因頻率為76.1%，G等位基因頻率為23.9%，AA、AG和GG基因型頻率分別為63.4%、25.4%、11.2%，T2DM組與NC組之間基因型頻率和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組的IRS1基因rs7578326位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率見表3。

表3 4組IRS1 rs7578326位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布及比較[n（%）］Tab. 3 Distribution and comparison of genotype，allele frequency at IRS1 rs7578326 of the four groups[n（%）］

2.2.4 組內(nèi)IRS1基因rs7578326位點(diǎn)的不同基因型與生化指標(biāo)的比較

組內(nèi)IRS1基因rs7578326位點(diǎn)的不同基因型與生化指標(biāo)的比較：在統(tǒng)計(jì)中將AG和AA基因型合并，作為A等位基因的攜帶者與GG基因型比較。在T2DM+高甘油三酯組中AA+AG 型人群TG、LDL-C水平均高于GG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NC組AA+AG 型人群LDL-C、TG水平均低于GG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高甘油三酯組AA+AG 型人群TC、TG、LDL-C水平均高于GG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 組內(nèi)不同基因型生化指標(biāo)比較結(jié)果（±s）Tab. 4 Comparison of biochemical indexes of different genotypes in the group（±s）

表4 組內(nèi)不同基因型生化指標(biāo)比較結(jié)果（±s）Tab. 4 Comparison of biochemical indexes of different genotypes in the group（±s）

注：攜帶A等位基因與GG型比較，*P＜0.05。

檢測指標(biāo)/（mmol·L-1）TC TG HDL-C LDL-C T2DM組GG（n=8）4.20±0.93 1.32±0.27 1.41±0.36 2.80±1.80 AA+AG（n=91）4.62±0.75 3.38±1.97*1.10±0.19 2.72±0.82*AA+AG（n=63）4.51±0.66 1.36±0.19 1.39±0.32 2.73±0.56 NC組GG（n=4）3.97±0.36 1.32±0.16 1.33±0.08 2.64±0.26 AA+AG（n=74）3.99±0.64 1.20±0.27*1.24±0.19 2.30±0.59*高甘油三酯組GG（n=4）4.28±0.73 2.01±0.27 1.08±0.36 2.11±0.79 AA+AG（n=89）4.54±0.55*2.81±1.32*1.13±0.25 2.36±0.55*T2DM+高甘油三酯組GG（n=4）4.53±1.12 3.01±1.57 1.15±0.16 2.38±0.84

3 討論

糖尿病是一種由胰島素分泌異常和胰島素活性異常所導(dǎo)致的代謝性綜合性疾病，一般伴隨糖、蛋白質(zhì)和脂肪等代謝紊亂的高血糖癥狀，其中，2型糖尿?。═2DM）占整個(gè)糖尿病人群的80%~90%[12］。近些年來，我國蒙古族人群糖尿病患病率也呈明顯增高趨勢[13-14］。T2DM的特征主要表現(xiàn)為胰島素抵抗，胰島素受體底物1（IRS1）是胰島素受體酪氨酸激酶底物，是介導(dǎo)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白[15-16］。目前有研究認(rèn)為，胰島素受體底物（IRSs）家族與T2DM發(fā)病相關(guān)，IRS1基因作為一個(gè)重要的候選基因，在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制研究方面較為深入[17］。本研究顯示，T2DM+高甘油三酯組和T2DM組TC、LDL-C的平均水平均高于正常對照組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T2DM+高甘油三酯組TC、TG的平均水平均高于T2DM組，HDL-C的平均水平低于T2DM 組。T2DM+高甘油三酯組的平均年齡、TG、LDL-C 的平均水平均高于高甘油三酯組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T2DM組與對照組相比，腰圍、舒張壓和收縮壓差異顯著（P<0.05），說明腹型肥胖和高血壓可能是蒙古族T2DM患病的主要因素，以往也有相關(guān)研究證明SBP是T2DM 的危險(xiǎn)因素[12］，與本研究結(jié)果一致。又因蒙古族人群飲食上更易偏好飲酒、喜食奶制品及肉類等，致使所攝入的脂肪過量，同時(shí)也受環(huán)境因素的雙重影響，容易發(fā)生肥胖和血脂異常等情況。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，T2DM+高甘油三酯組rs7578326 位點(diǎn)等位基因A、G 的頻率分別為85.8%、14.2%，AA、AG 和GG 基因型頻率分別為75.8%、20.0%、4.2%，NC 組等位基因A、G 的頻率分別為76.3%、23.7%，AA、AG和GG基因型頻率分別為57.7%、37.2%、5.1%，高甘油三酯組等位基因A、G的頻率分別為83.3%、16.7%，AA、AG和GG基因型頻率分別為71.0%、25.0%、4.0%。與對照組相比，T2DM+高甘油三酯組和高甘油三酯組基因型頻率和等位基因頻率差異顯著，且A等位基因的頻率較NC組顯著升高（P<0.05）。在T2DM+高甘油三酯組中，AA+AG 型人群TG、LDL-C 水平顯著高于GG 型，高甘油三酯組AA+AG 型人群TC、TG、LDL-C 水平均高于GG 型，NC 組AA+AG 型人群LDL-C、TG 水平均低于GG 型，說明SNP rs7578326位點(diǎn)多態(tài)性可能與患者脂質(zhì)的代謝相關(guān)。此前有研究表明，2型糖尿病伴甘油三酯增高者會加重胰島素抵抗[18］，因極低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯產(chǎn)生得過多和清除缺陷會使病情加重，因此，更加需要注重糖尿病血脂異常的防治工作。

綜上所述，本研究顯示T2DM+高甘油三酯組等位基因A的頻率較NC組顯著升高，且A等位基因頻率與TG水平呈正相關(guān)，故推測IRS1基因rs7578326位點(diǎn)等位基因A與蒙古族2型糖尿病合并高甘油三酯關(guān)聯(lián)，其具體的基因功能以及發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。