大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究

畢海林，木永青，郭 淼，和加衛(wèi)，王朝文，和志嬌，楊燕林，楊正松*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199；2.麗江藍(lán)瑪生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，云南 麗江 674100）

大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號(Gisela 6)由德國育成，是酸櫻桃(Prunus cerasus L)與灰毛葉櫻桃(Prunus canescens)進(jìn)行種間雜交培育的三倍體雜種，其植物學(xué)性狀特點(diǎn)類似于灰毛葉櫻桃，在歐洲、北美地區(qū)被廣泛種植，并于1998年經(jīng)美國引入我國，于2004年12月通過國家林業(yè)和草原局林木良種審定。塞拉6號與大多數(shù)大櫻桃品種的親合性良好，具有明顯的矮化、豐產(chǎn)、早實(shí)性強(qiáng)、抗病、耐澇、土壤適應(yīng)范圍廣、固地性能好、抗寒、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。栽植嫁接苗3年可見果，5年可達(dá)豐產(chǎn)。吉塞拉6號與大櫻桃品種的適配性好，很少出現(xiàn)排斥現(xiàn)象，這也是吉塞拉6號能夠迅速在我國推廣應(yīng)用的原因［1-2］。吉塞拉6號為無性系砧木，不能采用種子繁殖；扦插繁殖需要大量的枝條且速度較慢，不能在短期內(nèi)獲得大量砧木苗。本文對大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，摸索出了吉塞拉6號的組織培養(yǎng)及其快速繁殖技術(shù)，為大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號的工廠化育苗以及大櫻桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

吉塞拉6號枝條取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所麗江美自科研基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與初代培養(yǎng) 以吉塞拉6號帶腋芽莖段作為外植體。4月初對吉塞拉6號的嫩枝條進(jìn)行處理，剪成帶1個腋芽的莖段。外植體消毒和接種按以下方式進(jìn)行：將莖段用洗衣粉液浸泡10 min，流水沖洗2 h，然后放入超凈臺，70%乙醇消毒30 s，無菌水浸洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒6 min，無菌水浸洗5次后供接種使用，莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。8種誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA上，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度3000 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)基pH值5.8，蔗糖30 g/L。每瓶培養(yǎng)基接種1個莖段，以50個莖段為1個組合，分別重復(fù)3次，接種后觀察并記錄莖段的生長變化情況，45 d后對莖段的生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基。將初代培養(yǎng)腋芽萌發(fā)的新枝剪成約1 cm的莖段，接種到含不同激素配比的增殖培養(yǎng)基上。8種增殖培養(yǎng) 基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同，每瓶接4個莖段，45 d后測量苗的高度、叢生芽數(shù)，以及統(tǒng)計(jì)新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)瓶數(shù)，每種配方統(tǒng)計(jì)測量3瓶。

1.2.3 試管內(nèi)生根培養(yǎng)與煉苗移栽 將試管苗剪去基部愈傷組織，并剪成約3 cm的莖段，接種到生根培養(yǎng)基中。4種生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+2.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC，其中，AC為活性炭，每瓶接種20苗，培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)相同，蔗糖為15 g/L。第45天觀察統(tǒng)計(jì)其生根的情況，每種配方統(tǒng)計(jì)測量3瓶。

煉苗移栽按采用以下4種方式：(1)生根培養(yǎng)第3天進(jìn)行試管苗煉苗，第10天進(jìn)行移栽；(2)生根培養(yǎng)第13天進(jìn)行試管苗煉苗，第20天進(jìn)行移栽；(3)生根培養(yǎng)第23天進(jìn)行試管苗煉苗，第30天進(jìn)行移栽；(4)生根培養(yǎng)第33天進(jìn)行試管苗煉苗，第40天進(jìn)行移栽。

試管苗煉苗即將培養(yǎng)瓶微開蓋，3 d后將瓶蓋打開1/3左右，再過2 d將瓶蓋去除，2 d之后進(jìn)行洗苗并移栽至苗床。以草炭土+珍珠巖(10∶1)作為苗床基質(zhì)，移栽前用消毒劑將苗床進(jìn)行消毒，移栽時剪去部分葉片，移栽后要注意保持空氣相對濕度，并遮陰養(yǎng)護(hù)。30 d后統(tǒng)計(jì)試管苗的移栽成活率，并測量苗的生長量。

1.2.4 試管外生根 將試管苗剪去基部愈傷組織，并剪成約2 cm的莖段，蘸1000 mg/L IBA后分別扦插在粉碎苔蘚、草炭土+珍珠巖(20∶1)、椰糠+珍珠巖(20∶1)、松針粉+珍珠巖(20∶1)等4種基質(zhì)中，基質(zhì)分別盛放在70孔穴盤中，每種基質(zhì)觀察3盤，扦插后放入大棚的塑料小拱棚內(nèi)，觀察生根情況，并在第45天統(tǒng)計(jì)生根情況；第75~90天將穴盤苗上營養(yǎng)缽或進(jìn)行大田移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對吉塞拉6號初代培養(yǎng)的影響

由表1可以看出，吉塞拉6號帶腋芽的莖段在初代培養(yǎng)基中腋芽很快就開始萌發(fā)，多數(shù)在培養(yǎng)的第5天就開始萌發(fā)（圖1A）。8種培養(yǎng)基中腋芽的萌發(fā)率均在78.0%以上，在添加NAA的培養(yǎng)基中腋芽的萌發(fā)率比添加IBA的培養(yǎng)基中腋芽的萌發(fā)率略高，基本在80%以上，并且添加NAA的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)后伸長較多。第45天時進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測量，伸長的腋芽枝條長度普遍在3 cm以上。另外，對比4種激素濃度發(fā)現(xiàn)，較高濃度的生長素NAA和IBA更有利于吉塞拉6號腋芽枝條的萌發(fā)和生長，并且NAA比IBA的促進(jìn)效果更顯著。因此，選擇MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA可作為吉塞拉6號較佳的初代培養(yǎng)莖段腋芽的啟動培養(yǎng)基。

圖1 吉塞拉6號在各培養(yǎng)階段的生長情況

表1 不同激素配比對吉塞拉6號外植體萌發(fā)及生長的影響

2.2 不同激素配比對吉塞拉6號不定芽分化和增殖的影響

由表2可以看出，在不同濃度6-BA和NAA的繼代培養(yǎng)基中，吉塞拉6號均能較好地增殖，苗的基部均形成少量淡綠色愈傷組織，并分化形成較多的叢生芽（圖1B）。在6-BA濃度為1.0 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，產(chǎn)生叢生芽數(shù)也明顯隨之增多；在6-BA濃度為2.0 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，產(chǎn)生的叢生芽數(shù)也明顯增多。但是比較2種6-BA濃度發(fā)現(xiàn)，在NAA濃度相同時，6-BA濃度為2.0 mg/L的平均叢生芽數(shù)反而比6-BA濃度為1.0 mg/L時略少。不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基中苗高的差異不明顯。1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合的增殖系數(shù)最高，為11.03。故MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的增殖培養(yǎng)基。

表2 不同激素配比對吉塞拉6號不定芽分化和增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

2.3.1 不同濃度IBA對吉塞拉6號生根的影響 由表3可以看出，在4種生根培養(yǎng)基中，當(dāng)苗接種到生根培養(yǎng)基中之后，苗基部逐漸形成淡綠色、緊致的愈傷組織，約6 d后可以看到愈傷組織上出現(xiàn)根原基分化的跡象，隨后逐漸伸長成白色根（圖1C），再逐漸發(fā)育成粗壯的淡黃色被絨毛的肉質(zhì)根。隨著培養(yǎng)基中生長素IBA濃度的升高，苗基部愈傷組織也稍微隨之增大，生根數(shù)略微降低，但是根長卻隨IBA濃度的升高而伸長，生根率隨IBA濃度的升高而表現(xiàn)出略微降低的趨勢。綜合來看，1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6號較佳的生根培養(yǎng)基。

表3 不同濃度IBA對吉塞拉6號生根的影響

2.3.2 不同誘導(dǎo)生根時間對吉塞拉6號生根與成活率的影響 由表4可以看出，吉塞拉6號試管苗在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根第10天移栽時，根還很短，根數(shù)也很少，多為表面光滑的白色肉質(zhì)根，移栽時不用剪根，但生根率較低，僅為63.6%，移栽后的成活率也較低，這可能是根發(fā)育尚不成熟，在一定程度上影響了苗的正常生長。吉塞拉6號試管苗誘導(dǎo)生根第20天進(jìn)行移栽時，根還較短，平均根長為1.14 cm，但根數(shù)較多，是表面光滑的淡黃色肉質(zhì)根，生根率較高，達(dá)到87.5%，并且移栽后的成活率也較高，達(dá)到90.4%，說明此時根已經(jīng)發(fā)育較成熟，且由于移栽時不需要剪根，對根的損傷較小，所以苗在移栽后的成活率高。隨著吉塞拉6號試管苗在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根時間的延長，根越來越長，平均根數(shù)變化不明顯，生根率增長也不明顯，根逐漸發(fā)育成表面被絨毛的淡黃色粗但松軟的肉質(zhì)根，移栽時必須剪去底部一大段根，這將導(dǎo)致根系在一定程度上受到損傷，移栽后苗的成活率也略微降低。綜上所述，吉塞拉6號生根培養(yǎng)第13天時進(jìn)行試管苗煉苗，第20天時移栽，移栽后的成活率較高，為最佳的生根誘導(dǎo)和移栽時間。

表4 不同誘導(dǎo)生根時間對吉塞拉6號生根與成活率的影響

2.4 不同基質(zhì)對吉塞拉6號培養(yǎng)瓶外生根的影響

由表5可以看出，在4種基質(zhì)中，吉塞拉6號枝段基部均在第8天逐漸產(chǎn)生少量愈傷組織，第12或13天以后愈傷組織及其稍上方逐漸長出白色短根。吉塞拉6號在4種基質(zhì)中的生根率差異不明顯，均達(dá)到88%以上，其中以粉碎苔蘚基質(zhì)的生根率最高，為90.6%；在4種基質(zhì)中苗生根一段時間后，均開始逐漸長高，其中粉碎苔蘚、草炭土+珍珠巖2種基質(zhì)中的苗生根后長高較多，但兩者差異不大。綜合來看，粉碎苔蘚是吉塞拉6號較好的瓶外生根基質(zhì)。

表5 不同基質(zhì)對吉塞拉6號培養(yǎng)瓶外生根的影響

3 討論與結(jié)論

在云南用于大櫻桃生產(chǎn)的砧木中，吉塞拉6號砧木應(yīng)用最多，占總面積的60%；西南櫻桃、細(xì)齒櫻桃次之，占總面積的30%；其余砧木應(yīng)用則相對較少，僅占總面積的10%［3］。目前，有的地方還在采用喬化砧木作為大櫻桃砧木，但櫻桃的產(chǎn)量比較低，因此加大優(yōu)質(zhì)矮化砧木的繁育，能大力推動云南大櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展。國內(nèi)大櫻桃矮化砧木的繁育技術(shù)已有很多報道，如劉慶忠等［4-10］對大櫻桃矮化砧木吉塞拉系列進(jìn)行了研究，但是關(guān)于不同誘導(dǎo)生根時間對吉塞拉6號生根及煉苗移栽成活率的影響，以及大櫻桃矮化砧木培養(yǎng)瓶外生根技術(shù)鮮有研究報道。

筆者將大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號進(jìn)行培養(yǎng)瓶外生根即基質(zhì)扦插，整個過程不需要無菌操作，可以組織大量勞動力短期內(nèi)完成扦插工作，生根后除去小拱棚，過渡一段時間后可直接上營養(yǎng)缽或進(jìn)行大田移栽，這樣可以在一定程度上縮短育苗周期，并且有效地降低育苗成本，將大力促進(jìn)大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)?；a(chǎn)，進(jìn)而推動我國大櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在本試驗(yàn)中，雖然吉塞拉6號在粉碎苔蘚中的生根情況稍稍好點(diǎn)，但在松針粉中的生根率也較高，總體來看，松針粉的成本較低，因此在一些松針較豐富的地方，尤其在云南，可以因地制宜地選用松針粉作為吉塞拉6號的生根基質(zhì)。

本試驗(yàn)表明，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的初代培養(yǎng)莖段腋芽啟動培養(yǎng)基；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的繼代增殖培養(yǎng)基；1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6號較佳的生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)第13天進(jìn)行試管苗煉苗，第20天進(jìn)行移栽，移栽后的成活率較高，為最佳的生根誘導(dǎo)和移栽時間；粉碎苔蘚是吉塞拉6號較好的瓶外生根基質(zhì)。