枳殼黃酮提取物抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究

邱奕飛，張瀟雪，肖國生，杜慧慧，楊東林

1.重慶三峽學(xué)院（萬州 404120）；2.重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國際研究院（永川 402160）

枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙（Citrus aurantiumL.）及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[1]，含有豐富的活性成分，如生物堿、類黃酮、類檸檬苦素等，具有抗氧化、抗抑郁、抗炎和抗腫瘤等作用[2-3]。枳殼黃酮類成分含量是評(píng)價(jià)藥材成熟度及質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)[4]，黃烷酮和多甲氧基黃酮是其主要的黃酮類化合物。枳殼和枳實(shí)中主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，且不同品種的黃酮種類及含量存在顯著差異[5-6]。據(jù)報(bào)道，枳殼提取物能夠有效地清除DPPH自由基（最高可達(dá)59.89%），也可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS強(qiáng)度，起到良好的抗氧化效果[7-8]，還可降低小鼠體內(nèi)的炎癥因子IL-6，IL-1β和TNF-ɑ水平，起到抗炎作用[9-10]。但是目前并未有關(guān)于枳殼黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面的研究。

常見的消化道癌癥結(jié)直腸癌是全球高發(fā)癌癥，2020年中國結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)為55.5萬，死亡人數(shù)為28.6萬，分別占全球結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)、死亡人數(shù)的28.8%和30.6%[11]。因此，結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅人類健康，是亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一。天然產(chǎn)物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到廣泛關(guān)注。此研究以枳殼為研究對象，通過高效液相色譜法分析枳殼質(zhì)量，并提取枳殼總黃酮，結(jié)合MTT試驗(yàn)和細(xì)胞凋亡試驗(yàn)分析枳殼總黃酮的抗腫瘤活性，以期為結(jié)直腸癌疾病的預(yù)防及治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳殼（重慶市銅梁區(qū)子奇藥業(yè)有限公司）；HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞（重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國際研究院）。

HPLC≥98%的柚皮苷對照品、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、青霉素、鏈霉素混合液（×100）、0.4%臺(tái)盼藍(lán)（美國Sigma公司）；HCT116細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.05%胰酶-EDTA消化液（trypsin-ethylene diaminetetraacetie acid，EDTA）：美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板（美國Corning公司）。Eppendorf AG高速冷凍離心機(jī)（德國）；奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Countess 3細(xì)胞計(jì)數(shù)器（賽默飛世爾科技）；Cycation 5多功能酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK）；Accuri C6 流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；GYXH-35臺(tái)式實(shí)驗(yàn)室制冰機(jī)（廈門國儀科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枳殼樣本的采集

重慶枳殼（重慶市銅梁區(qū)子奇藥業(yè)有限公司），選取未成熟青皮枳殼果實(shí)且表皮無明顯傷痕，采收后切片去核，在60 ℃烘干12 h后備用。渝枳殼、川枳殼（網(wǎng)購），選取枳殼具體信息見表1。

表1 枳殼樣品采集信息表

1.2.2 超高效液相色譜測定類黃酮含量分析

1.2.2.1 樣品預(yù)處理

樣品以5 000 r/min離心后，吸取2 mL上清液提取液置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容至刻度線，過0.22 μm親水性PTFE膜到2 mL進(jìn)樣小瓶，待測。

1.2.2.2 色譜條件

參照Zhao等[12]使用UPLC-PDA系統(tǒng)（Waters USA）對PMFs和黃烷酮進(jìn)行的測定和分析方法。具體方法：采用UPLC HC18色譜（2.10×100 mm，1.70 μm，UK），以0.01%（V/V）甲酸溶液（A相）和甲醇（B相）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0~0.6 min，10%~20% B；0.6~5 min，20%~70% B；5~7 min，70%~90% B；7~9 min，90%~10% B）；流速0.4 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長283 nm（黃烷酮）。

1.2.3 枳殼黃酮提取物的制備

枳殼黃酮提取物參考劉飛[13]方法，并做出一定改進(jìn)。稱取1 g的枳殼粉末，過0.25 mm篩后加入到35 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇中，溫度70 ℃，300 W，密封超聲20 min。抽濾后取濾液，加入5 g預(yù)處理后的AB-8大孔樹脂37 ℃振蕩24 h（100 r/min），抽濾后取出大孔樹脂，加入70 mL 75%乙醇，37 ℃振蕩12 h（100 r/min）抽取留濾液。取出濾液，在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無酒精，呈懸濁液后停止旋蒸，最后濾液在-80 ℃冰箱冷凍6 h后使用真空冷凍干燥機(jī)凍干，置于-80 ℃冰箱待用。

1.2.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存于液氮罐中的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇，即在37 ℃水浴鍋中迅速完全融化，于800 r/min離心5 min，棄去上清液，將HCT116接種于含10%胎牛血清的McCoy’s 5 a培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2、飽和濕度），定期換液，待細(xì)胞生長融合達(dá)80%~90%時(shí)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 MTT法檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性

取200 μL（1×103個(gè)/孔）對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的枳殼黃酮提取物和DMSO（陰性對照），使孔內(nèi)終濃度為0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200和400 μg/mL，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出各組細(xì)胞，棄上清液后每孔加入200 μL DMSO，搖床10 min，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為570 nm，記錄吸光度并計(jì)算枳殼總黃酮對細(xì)胞增殖的抑制率，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔[14]。細(xì)胞增殖抑制率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，按3.8×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，使用DMSO配制高濃度黃酮藥物，過0.22 μm濾膜備用。接種細(xì)胞12 h后按照1∶200（高濃度黃酮藥液∶培養(yǎng)基），使黃酮藥物終濃度為0，100，200和400 μg/mL。在5% CO2、37 ℃、飽和濕度下孵育24 h 后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心（800 r/min，5 min）收集細(xì)胞于5 mL流式管內(nèi)，然后用4 ℃的PBS洗兩次，再使用100 μL 1×Annexinbinding buffer重懸細(xì)胞，接著加入5 μL FITC-Annexin V和2 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，最后加入400 μL 1×Annexin binding buffer，檢測前放置于冰上。使用流式細(xì)胞儀檢測，每組計(jì)數(shù)至少1×105個(gè)細(xì)胞，對照組和試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS 20.0，GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，作圖和分析，每組試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次。數(shù)據(jù)以x±s表示。采用單因素ANOVA檢驗(yàn)分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源枳殼黃酮含量分析

由表2可知，所測樣本中渝枳二號(hào)柚皮苷含量大于7.5%，新橙皮苷含量大于5%，且總黃酮含量大于15%，有效活性黃酮類物質(zhì)含量都高于其他樣本。

表2 枳殼樣品黃酮含量 單位：%

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷等黃酮類成分均具有較強(qiáng)的藥理作用，均為枳殼的有效活性物質(zhì)[14-16]。柚皮苷含量范圍在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%，橙皮苷含量在0.12%~3.45%，蕓香柚皮苷含量在0.1%~3.62%。因此，可用這4個(gè)指標(biāo)含量來評(píng)價(jià)枳殼的質(zhì)量。根據(jù)公司檢測標(biāo)準(zhǔn)和2020年《中國藥典》篩選出一級(jí)枳殼進(jìn)行活性物質(zhì)提取。

2.2 枳殼黃酮提取物中總黃酮含量

此研究采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，繼而用大孔樹脂純化并冷凍干燥得到枳殼黃酮提取物，其黃酮得率為11.82%，略高于用CA(OH)2法提取枳殼總黃酮的得率8.06%[17]，說明提取方法是可行的。

2.3 枳殼總黃酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞活性的影響

由圖1（A）可知，枳殼黃酮提取物能夠抑制HCT116的增殖，呈濃度依賴關(guān)系。從表3可以看出：枳殼黃酮提取物質(zhì)量濃度為1.56 μg/mL時(shí)，可顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；枳殼黃酮質(zhì)量濃度大于6.25 μg/mL時(shí)，對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用顯著性增強(qiáng)（P＜0.01），質(zhì)量濃度為6.25~400 μg/mL時(shí)極顯著地降低了HCT116細(xì)胞的增殖能力（P＜0.001），其中最高濃度抑制率為60.83%。此外，通過MTT實(shí)驗(yàn)測得枳殼黃酮抑制HCT116細(xì)胞的IC50值為317.2 μg/mL（圖1B）。

圖1 黃酮提取物對HCT116細(xì)胞活性的影響

表3 枳殼黃酮提取物對HCT116細(xì)胞的影響

2.4 枳殼總黃酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

將枳殼黃酮提取物處理的HCT116細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析枳殼黃酮對HCT116細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。通過流式分析發(fā)現(xiàn)，隨著藥物質(zhì)量濃度上升，細(xì)胞凋亡率逐漸升高（圖2）。對照組細(xì)胞在12 h后的早期凋亡率為1.4%，晚期凋亡率為11.2%。在處理組中，晚期凋亡率隨黃酮提取物濃度的增加而有輕微增加，當(dāng)400 μg/mL質(zhì)量濃度處理12 h后晚期凋亡率達(dá)到13.7%，高于對照組，這與徐一鳴等[18]報(bào)道的類似。因此，枳殼黃酮提取物能夠輕微誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，這可能是提取物發(fā)揮抗癌作用的原因之一。

圖2 黃酮提取物對HCT116細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

不同枳殼樣品的有效成分存在較大的差異，同一產(chǎn)地不同采樣時(shí)間和種植特性也會(huì)影響質(zhì)量，民間多使用江西樟樹、新干和重慶江津、綦江等較優(yōu)品質(zhì)的枳殼[19]。隨著枳殼的引種栽培，如何保證枳殼的質(zhì)量是關(guān)鍵問題。因此，需要建立高效快速的檢測技術(shù)分析不同產(chǎn)地枳殼的活性成分的含量。根據(jù)2020年《中國藥典》所規(guī)定，枳殼原藥材、枳殼飲片與麩炒枳殼中柚皮苷含量不小于4%，新橙皮苷含量不小于3%。從所測不同批次、不同規(guī)格的枳殼樣本來看，Y092與川枳殼兩批枳殼柚皮苷含量不合格，Y540與Y660則柚皮苷、新橙皮苷含量均不合格。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)購的不同產(chǎn)地的枳殼樣本中活性物質(zhì)含量均較為低下?？梢婅讱さ馁|(zhì)量與產(chǎn)地、種植方式、果實(shí)成熟度、運(yùn)輸保存方式等有著密不可分的關(guān)系。如隨著枳殼果實(shí)成熟程度的增加果肉含量增加，果皮含量減少，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量下降[20]。因此不同批次檢測出柚皮苷與新橙皮苷的含量低可能與枳殼采收時(shí)期與品種有關(guān)。

枳殼中的化學(xué)組分較多，含有黃酮類、香豆素類，揮發(fā)油類等成分，具有抗菌、降血脂、抗腫瘤和抗抑郁等作用[21-23]，其中枳殼中的黃酮類化合物利膽、抗癌、抗病毒，且對多種腫瘤具有較好的抗腫瘤活性[24]。枳殼中的多甲氧基黃酮類物質(zhì)能降低胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、纖維瘤等腫瘤細(xì)胞活性，可作為抗癌物質(zhì)開發(fā)[25-27]。據(jù)報(bào)道，川陳皮素以劑量和時(shí)間依賴性來降低口腔鱗狀癌細(xì)胞活力，并能顯著抑制肺腫瘤活性，減少腫瘤體積[28-29]。另外，枳殼中的檸檬素可改善直腸癌小鼠的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等[30]。此研究在枳殼總黃酮提取物在400 μg/mL處理48 h可最大限度地降低HCT116細(xì)胞生存率，可能與該濃度提取物處理48 h的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡升高有關(guān)，但細(xì)胞凋亡率上升幅度并不明顯可能是處理時(shí)間過短的原因，后續(xù)可以進(jìn)一步延長處理時(shí)間。

雖然枳殼的藥理作用較多，但是相應(yīng)的作用機(jī)制研究不深入，需要結(jié)合組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)深入探討。除此之外，枳殼在保健食品的開發(fā)上較少，將活性成分應(yīng)用于保健食品、藥品也是亟待解決的問題，如枳殼多糖的免疫作用。

4 結(jié)論

通過高效液相色譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，不同枳殼樣品的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量存在較大的差異，其中柚皮苷含量在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%。22個(gè)樣品中符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的有18個(gè)樣品，合格率為81.8%。通過超聲波輔助提取優(yōu)質(zhì)品種的枳殼黃酮，發(fā)現(xiàn)其對HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞具有顯著抑制效果（P＜0.05）且呈量效關(guān)系，48 h內(nèi)黃酮提取物（400 μg/mL）對結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的抑制率為60.83%，IC50值為317.2 μg/mL，細(xì)胞晚期凋亡率為13.7%。枳殼黃酮提取物能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖活性，為枳殼黃酮抗腫瘤活性的研究提供理論依據(jù)。