牛乳中原生低聚半乳糖的酶法合成及響應(yīng)面優(yōu)化

羅俊溢，武倫瑋，付永剛，巴根納，韓仁嬌 ，金麗娜

1.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司（呼和浩特 011500）；2.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司（呼和浩特 010110）；3.國家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（呼和浩特 010110）

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide，GOS）是在乳糖分子的半乳糖基側(cè)以β-糖苷鍵的形式連接1~7個(gè)半乳糖基形成的混合雜聚糖[1-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)研究表明，食用GOS后會(huì)刺激腸道益生菌（以乳酸菌和雙歧桿菌為主）的增殖，腸道益生菌菌株比例增加后，則會(huì)抑制腸道有害菌群的增長，并起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及組成等作用[5-6]，進(jìn)一步可實(shí)現(xiàn)改善機(jī)體對(duì)礦物元素的吸收[7]、便秘的預(yù)防和改善[8]、肥胖的預(yù)防和改善[9]、齲齒的預(yù)防[10]、血清膽固醇水平的降低[11]甚至腫瘤的防治[12]等對(duì)人體健康能產(chǎn)生積極影響的功能。因此將GOS的研究運(yùn)用到新食品的開發(fā)具有重要意義。

經(jīng)過提純后的GOS的外觀通常為半透明的微黃色或者無色，黏度較低、甜度約為蔗糖的25%，在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性好，對(duì)熱的穩(wěn)定性也較高，口感和品質(zhì)均較為優(yōu)異[13-14]?，F(xiàn)階段關(guān)于GOS的提取或制備方式主要有4種：一是天然分離法，主要從食品原料中直接分離出GOS，但是食品中的GOS通常表現(xiàn)為電中性，對(duì)其有效分離較難[14-15]；二是水解法，主要通過對(duì)多糖進(jìn)行水解，并提取水解產(chǎn)物中低聚糖，但多糖的成分相對(duì)復(fù)雜，其水解產(chǎn)物多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，以致GOS的轉(zhuǎn)化率通常不高，難以獲得含量較高的GOS產(chǎn)品[16]；三是化學(xué)合成法，通過有機(jī)合成原理制備GOS，但是該法通常存在提取試劑毒性較大，且合成的低聚糖類混合物中的α-或β-鍵的結(jié)構(gòu)缺乏特異性等缺點(diǎn)，使其很難大量運(yùn)用于食品加工業(yè)中[17-18]；四是酶法合成，主要通過一種特異性的β-半乳糖苷酶將乳糖轉(zhuǎn)化為GOS，該酶可以特異性地催化乳糖末端的非還原性的β-d-半乳糖苷單元，使其水解為半乳糖苷，同時(shí)催化糖苷配基部分之間的糖苷鍵的水解并產(chǎn)生葡萄糖苷，通過乳糖的半乳糖基化反應(yīng)催化GOS化合物的合成[19-20]。酶法合成GOS的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)溫和、安全、高效，且不會(huì)產(chǎn)生有害副產(chǎn)物，因此非常適合將其直接運(yùn)用于食品加工產(chǎn)業(yè)中，同時(shí)現(xiàn)已經(jīng)商業(yè)化的GOS就是以乳糖為底物通過酶法合成所得。

對(duì)于新型酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)，通常遇到的一個(gè)主要問題是若涉及新工藝的引入，其可能會(huì)促成較大的設(shè)備改造投入，給企業(yè)經(jīng)營造成負(fù)擔(dān)，如果需要利用牛奶中的乳糖通過酶的作用自合成GOS并做成酸奶，一般有2條途徑：一是在牛奶的配料階段加入酶進(jìn)行合成，在這個(gè)階段若需要達(dá)到合適的GOS產(chǎn)量，則需要多加一個(gè)酶解罐，增加產(chǎn)品生產(chǎn)投入；二是需要在牛奶的發(fā)酵階段加入，但是一般酸奶的發(fā)酵時(shí)間在5 h左右，因此需要了解為了達(dá)到宣稱含量[膳食纖維（以低聚半乳糖計(jì)）≥1.5%]的底物含量、酶添加量和酶解時(shí)間的基本關(guān)系，以更好地將其用于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

以牛乳中的乳糖為研究對(duì)象，通過酶法直接將牛乳中的乳糖合成為GOS，探究41 ℃條件下底物濃度、β-半乳糖苷酶添加量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)GOS產(chǎn)率的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

β-半乳糖苷酶（來源兩歧雙歧桿菌，杜邦公司）；牛奶（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；乳糖（來源牛奶，荷蘭菲仕蘭公司）；淀粉葡萄糖苷酶、麥芽二糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）、氰基硼氫化鈉：均為Sigma公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、二甲基亞砜（色譜純）：均為天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨、甲酸、2-氨基苯甲酰胺（均為上海安普有限公司）；乳酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；BSA223S分析天平[賽多斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；PB-10 pH儀[賽多斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELAOSB-2100油浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）；Sorvall ST8離心機(jī)（美國賽默飛公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛奶中GOS含量的檢測方法確立

參考文獻(xiàn)[21-24]的方法，使用熒光標(biāo)記-酶識(shí)別-高效液相色譜法定量測定牛奶中的GOS含量。

1.3.2 初始乳糖濃度對(duì)合成GOS的影響探究

牛乳中初始乳糖濃度分別設(shè)定為5.0%，5.5%，6.0%，6.5%和7.0%，將其高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，加入0.1%β-半乳糖苷酶用于合成GOS，待反應(yīng)3 h后滅酶（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.3β-半乳糖苷酶添加量對(duì)合成GOS的影響探究

設(shè)定牛乳中的乳糖含量7.0%，高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，分別添加0，0.05%，0.1%，0.15%和0.2%β-半乳糖苷酶，待反應(yīng)3 h后做滅酶處理（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成GOS的影響探究

設(shè)定牛乳中的乳糖含量7.0%，高溫滅菌（95 ℃，5 min）并冷卻至41 ℃，添加0.1%β-半乳糖苷酶，待分別反應(yīng)1，2，3，4，5，6和7 h后做滅酶處理（沸水浴10 min），冷卻至室溫后用于檢測酶解液中的GOS含量。

1.3.5 牛奶中GOS合成的響應(yīng)面法優(yōu)化與驗(yàn)證

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始乳糖濃度、β-半乳糖苷酶添加量和反應(yīng)時(shí)間為響應(yīng)變量，分別用A、B、C表示，以GOS含量（Y）為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析，完成酶解合成GOS的優(yōu)化，選取優(yōu)化結(jié)果予以驗(yàn)證預(yù)測值和實(shí)際值的差距。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin、Excel、Design-Expert軟件進(jìn)行處理及作圖，使用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始乳糖含量對(duì)GOS合成的影響

不同初始乳糖含量的牛乳在41 ℃酶解條件下對(duì)GOS合成的影響如圖1所示。隨著牛乳中初始乳糖含量的提高，GOS的合成量也隨之上升，說明底物濃度對(duì)酶的水解效率呈正相關(guān)。牛乳中的初始乳糖含量大于6.5%時(shí)，GOS的合成速率減慢，說明在該酶濃度條件下，酶解效率逐漸接近飽和；而在初始乳糖含量6.0%~6.5%時(shí)，GOS的合成增長速率最快，說明在此區(qū)間酶的作用條件較適宜。同時(shí)考慮最終合成的GOS含量需要在1.5%以上及存在±0.2%的檢測誤差，進(jìn)一步結(jié)合生產(chǎn)成本考量，選取初始乳糖含量5.5%，6.1%和6.7%作為響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計(jì)值。

圖1 初始乳糖含量對(duì)GOS合成的影響

2.2 β-半乳糖苷酶添加量對(duì)GOS合成的影響

41 ℃條件下不同β-半乳糖苷酶添加量對(duì)牛乳中β-半乳糖苷酶的酶解合成GOS效率方面的影響如圖2所示。β-半乳糖苷酶添加量0時(shí)，GOS合成量為0，說明牛乳中的乳糖在該溫度下自然水解無法形成GOS。β-半乳糖苷酶添加量0.05%時(shí)，GOS的合成量較少，β-半乳糖苷酶添加量0.10%時(shí)，相對(duì)于0.05%添加量，GOS合成量有明顯的提高，說明酶對(duì)GOS合成量的影響是一個(gè)主要因素，當(dāng)添加量0.15% GOS時(shí)合成量達(dá)到最大，而β-半乳糖苷酶添加量0.20%時(shí)，GOS合成量降低，分析原因是β-半乳糖苷酶添加量過多，同時(shí)該酶也會(huì)特異性地催化GOS末端的非還原性的β-d-半乳糖苷單元，使其水解為半乳糖苷，同時(shí)催化糖苷配基部分之間的糖苷鍵的水解并產(chǎn)生葡萄糖苷，進(jìn)一步隨著底物含量越來越少，GOS的合成速率會(huì)逐漸低于GOS的分解速率，從而導(dǎo)致宏觀檢測GOS含量的減少。結(jié)合生產(chǎn)成本控制考慮，響應(yīng)面優(yōu)化中β-半乳糖苷酶添加量選擇0.05%，0.10%和0.15%。

圖2 β-半乳糖苷酶添加量對(duì)GOS合成的影響

2.3 酶解時(shí)間對(duì)GOS合成的影響

不同酶解時(shí)間對(duì)GOS合成的影響如圖3所示。隨著酶解時(shí)間的延長，牛乳中GOS的合成量也在不斷提高，酶解時(shí)間在前2 h，牛乳中的GOS含量增長緩慢，說明前2 h酶的狀態(tài)處于一種活化的狀態(tài)，分解效率不高。但在酶解3~4 h，GOS的合成速率有較明顯提升，說明此時(shí)酶的活化已完成，且酶解效率也能達(dá)到最大，但酶解達(dá)5 h后，GOS的合成速度減慢，分析原因是此時(shí)剩余的底物不足以支持酶的高效作用。酶解時(shí)間7 h時(shí)，GOS合成量出現(xiàn)降低，說明此時(shí)的底物不夠合成GOS，同時(shí)酶對(duì)GOS的分解速率大于其合成速率。考慮酶解時(shí)間在5 h后變化趨勢較小，從第3小時(shí)開始GOS含量達(dá)1.5%左右，因此重點(diǎn)研究3~5 h過程中GOS含量的變化情況。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)GOS合成的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化牛乳中GOS的合成

2.4.1 試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑴c顯著性檢驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，確定按乳糖含量（A）、β-半乳糖苷酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以GOS含量（Y）為響應(yīng)值，利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到擬合方程：Y=2.234+0.187 5A+0.566 3B+0.176 3C+0.105AB-0.02AC-0.107 5BC+0.061 8A2-0.220 8B2-0.034 3C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。模型的F值為37.893 8（P＜0.000 1），表明整體模型達(dá)到顯著，F(xiàn)Lackoffit值為0.989 5（P=0.482 675），失擬結(jié)果不顯著，說明不確定因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小。模型中R2=0.979 8，Radj2=0.954 0，表明該模型可以很好地解釋GOS合成量的變化，即該模型的擬合度良好，可用于描述GOS合成量與乳糖含量、β-半乳糖苷酶添加量、酶解時(shí)間之間的關(guān)系。由表3還可以得出，因素A（乳糖含量）和C（酶解時(shí)間）對(duì)牛乳中GOS合成含量達(dá)到顯著水平，因素B（β-半乳糖苷酶添加量）對(duì)牛乳中GOS合成達(dá)到極顯著水平。乳糖含量、β-半乳糖苷酶添加量及酶解時(shí)間對(duì)牛乳中GOS的合成影響順序?yàn)棣?半乳糖苷酶添加量＞乳糖含量＞酶解時(shí)間。該試驗(yàn)所建立的模型中A和B、B和C及A和C之間的交互影響均不顯著。此外，B2對(duì)GOS合成的影響達(dá)到顯著水平，而A2與C2對(duì)GOS合成率的影響不顯著。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果及顯著性檢驗(yàn)

2.4.2 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸擬合，交互作用的等高線及響應(yīng)曲面如圖4所示，通過對(duì)比分析3組圖中的曲線的平滑與陡峭程度，可以直觀看出各因素之間的交互作用對(duì)GOS合成量的影響。從圖4（a）可以看出，β-半乳糖苷酶添加量對(duì)牛乳中GOS合成量的影響大于牛乳中的乳糖含量。從圖4（b）可以看出，β-半乳糖苷酶添加量對(duì)牛乳中GOS合成量的影響大于酶解時(shí)間。從圖4（c）可以看出，乳糖含量和酶解時(shí)間對(duì)牛乳中GOS合成量的影響不明顯。這與方差分析結(jié)果相吻合。

圖4 響應(yīng)曲面圖

2.4.3 最佳工藝條件的預(yù)測與檢驗(yàn)

通過Design-Expert軟件預(yù)測出牛乳中原生GOS合成的最佳工藝參數(shù)：牛乳中的乳糖含量6.12%、β-半乳糖苷酶添加量0.082%、酶解時(shí)間4.2 h，在此條件下GOS合成量為2.12%。鑒于工藝的可操作性，將其調(diào)整為乳糖含量6.0%±0.2%，β-半乳糖苷酶添加量0.09%±0.01%，酶解時(shí)間4.5±0.5 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下牛乳中GOS合成量達(dá)2.07%±0.15%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法中的Box-Behenken中心組合方法，得到理論最佳工藝，對(duì)酶法合成低聚半乳糖的配方工藝進(jìn)行優(yōu)化，并很好地證明模型的可靠性。其中，最佳響應(yīng)優(yōu)化理論值為牛乳中的乳糖含量6.12%、β-半乳糖苷酶添加量0.082%、酶解時(shí)間4.2 h，理論合成量為2.12%。為增強(qiáng)工藝的可操作性，經(jīng)微調(diào)后得到最適酶法合成GOS的工藝條件：加酶量0.09%±0.01%、牛乳中初始乳糖含量6.0%±0.2%、反應(yīng)時(shí)間4.5±0.5 h。在此條件下，GOS合成量達(dá)2.07%±0.15%。其中各因素對(duì)GOS合成量的影響順序?yàn)棣?半乳糖苷酶添加量＞乳糖含量＞酶解時(shí)間。通過對(duì)41 ℃溫度下酶法合成GOS的配方工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)探究，有助于在真實(shí)發(fā)酵環(huán)境下，對(duì)于酶法合成GOS的酸奶開發(fā)提供必要的指導(dǎo)和參考。