響應(yīng)面法優(yōu)化柚子皮總黃酮提取工藝

郭 詩，王星宇，郭佳妮，彭馨睿，朱慧楠，廖明星，繆園欣

（1.荊楚理工學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖北 荊門 448000；2.湖北省荊門市畜牧獸醫(yī)局，湖北 荊門 448000）

柚子（Citrus grandis L.）是蕓香科柑橘屬植物，具有潤肺、清腸、健脾胃等功效[1]，其營養(yǎng)豐富，富含糖類、維生素、類黃酮等營養(yǎng)成分[2-5]。柚子皮是柚子的重要副產(chǎn)物，約占鮮果重的20%～50%，富含果膠[6]、纖維素[7]、柚皮苷、柚皮蕓香苷[8]、黃酮類化合物[9]。對柚子皮的功效進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其具有降脂、抗氧化、殺菌消炎等藥用功效[10-11]。目前，柚子皮主要用于制作蜜餞、飲品及肥料，或作為廢棄物丟棄[12]。柚子皮中活性成分含量較高，可作為果膠、多酚、多糖等提取的理想原料[13]。有研究證實(shí)可通過纖維素酶輔助法、超聲波法、微波消解法等對柚子皮中的功能性成分進(jìn)行提取。

黃酮類物質(zhì)是光合作用產(chǎn)生的天然抗氧化劑，具有降糖、降脂、抗腫瘤、抗過敏等生物活性[14-17]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。以柚子皮為原料進(jìn)行黃酮提取，既可以合理利用柚子皮來增加經(jīng)濟(jì)效益，又可以生產(chǎn)出更多的黃酮類物質(zhì)應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。黃酮類物質(zhì)抗氧化效應(yīng)和藥用價值顯著，對人體健康具有重要的作用。能夠提取黃酮的植物種類很多，但不同植物的黃酮含量有較大的差異，目前，植物黃酮的提取主要集中在銀杏葉、刺梨等，以柚子皮等水果副產(chǎn)物作為黃酮提取來源相對較少。本試驗(yàn)以柚子皮為原料進(jìn)行黃酮提取，并通過單因素試驗(yàn)得到料液比、乙醇濃度、超聲時間和微波時間4個因素的優(yōu)水平，然后采用響應(yīng)面法對柚子皮黃酮的超聲-微波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為工業(yè)化提取柚子皮黃酮物質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟柚子：市售，蕓香葉苷（蘆?。罕本┧魅R寶科技有限公司，亞硝酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠，氫氧化鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠，硝酸鋁：天津市耀華化工廠，95%乙醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司，TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，SB25-12D型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司，微波爐：廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司，破壁機(jī)：九陽股份有限公司，F(xiàn)A224C型電子分析天平：上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

取新鮮、無腐爛柚子皮洗凈后切成小塊，置于60℃烘干箱中烘干，隨后用萬能粉碎機(jī)對其進(jìn)行粉碎并過380滋m篩子得到柚子皮粉，粉碎好的柚子皮粉密封裝瓶于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

于105℃烘箱中將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒重，隨后稱取20 mg置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇將其完全溶解并定容至刻度，配制成濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5 mL于25 mL的具塞刻度試管中，向試管中分別加入1 mL 5%的NaNO2搖勻，靜置7 min。加入1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻靜置7 min。加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，搖勻靜置12 min后用60%乙醇定容至刻度，靜置10 min。最后，在510 nm波長處測得吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。

1.3.3 柚子皮總黃酮的測定

精密稱取柚子皮粉1.000 g，按不同的料液比加入不同濃度乙醇，超聲-微波協(xié)同提取一定時間。提取完成后濃縮至20 mL，再用60%乙醇定容至50 mL得到總黃酮提取液，按1.3.2的方法操作測得總黃酮濃度，并依據(jù)下列公式計(jì)算得出總黃酮提取率。

式中，C為柚子皮樣品中總黃酮的濃度（mg/mL）；V為樣品溶液稀釋液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 柚子皮總黃酮提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.4.1 料液比對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 1.000 g樣品，分別按 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）的料液比加入 70%的乙醇，超聲處理20 min，再在350 W微波功率下提取1.5 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測定吸光度，并計(jì)算柚子皮總黃酮得率。

1.3.4.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 1.000 g 樣品，按 1∶20（g∶mL）的料液比分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，超聲處理20 min，再在350 W微波功率下提取1.5 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測定吸光度，并計(jì)算柚子皮總黃酮得率。

1.3.4.3 超聲時間對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 1.000 g 樣品，按 1∶20（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，分別超聲處理10、15、20、25、30 min，再在350W微波功率下提取1.5 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測定吸光度，并計(jì)算柚子皮總黃酮得率。

1.3.4.4 微波時間對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 1.000 g 樣品，按 1∶20（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，超聲處理15 min，再在350 W微波功率下提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測定吸光度，并計(jì)算柚子皮總黃酮得率。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇4個單因素：料液比（A）、乙醇濃度（B）、微波時間（C）和微波時間（D）為變量，建立響應(yīng)曲面回歸模型，以總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，按照4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)曲面法試驗(yàn)。響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Response surface test designed factor level

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of rutin

根據(jù)圖1求得回歸方程y=9.434x-0.012，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，表明在該濃度范圍內(nèi)，蘆丁濃度和吸光度值之間擬合情況良好，可以按照該方程計(jì)算柚子皮溶液中總黃酮含量。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對柚子皮總黃酮提取率的影響

由圖2可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，柚子皮總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶20時，柚子皮總黃酮提取率達(dá)最大值，但當(dāng)料液比超過1∶20時，柚子皮總黃酮提取率逐漸降低。因此，料液比 1∶20（g∶mL）是有利于總黃酮提取的最佳料液比。

圖2 料液比對柚子皮總黃酮提取率的影響Figure 2 Effect of solid to liquid ratio on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.2 乙醇濃度對柚子皮總黃酮提取率的影響

由圖3可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的逐漸增大，總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為80%時，柚子皮黃酮具有較高的提取率。因此，乙醇濃度選擇80%較為適宜。

圖3 乙醇濃度對柚子皮總黃酮提取率的影響Figure 3 Effect of ethanol concentration on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.3 超聲時間對柚子皮總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲時間在10～15 min范圍內(nèi)，隨著超聲時間的延長柚子皮總黃酮提取率逐漸增加；當(dāng)超聲時間超過15 min時，柚子皮黃酮的提取率開始降低。因此，柚子皮黃酮提取的最佳超聲時間為15 min。

圖4 超聲時間對柚子皮總黃酮提取率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic time on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.4 微波時間對柚子皮總黃酮提取率的影響

由圖5可知，微波時間在0.5～1.0 min范圍內(nèi)，隨著微波時間的增加，柚子皮黃酮的提取率逐漸增加；當(dāng)微波時間持續(xù)增加超過1.0 min后，總黃酮提取率降低。因此，微波時間1.0min為最佳微波時間。

圖5 微波時間對柚子皮總黃酮提取率的影響Figure 5 Effect of microwave time on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇4個因素，料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時間（C）和微波時間（D）為變量建立響應(yīng)面回歸模型，柚子皮總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值。響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表3 柚子皮總黃酮提取率的方差分析Table 3 Analysis of variance of shaddock peel flavonoids extraction rate

以柚子皮總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行多元二次回歸擬合分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=1.41+0.033A+0.0038B+0.096C-0.034D-0.017AB-0.01AC-0.018AD+0.00025BC-0.022BD+0.0005CD-0.093A2+0.022B2-0.14C2-0.066D2。

對表2中總黃酮提取率進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表3。方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該回歸模型P<0.01極顯著，失擬項(xiàng)P=0.150>0.05不顯著，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.935 8，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.871 6，說明該模型能解釋87.16%響應(yīng)值的變化，因此使用該模型對柚子皮總黃酮提取工藝進(jìn)行分析和優(yōu)化是合適的。顯著性分析結(jié)果顯示，模型一次項(xiàng)C及模型二次項(xiàng)A2、C2、D2對柚子皮總黃酮提取率有極顯著的影響（P<0.01），模型一次項(xiàng)A、D對柚子皮總黃酮提取率有顯著的影響（P<0.05），交互作用項(xiàng)對柚子皮總黃酮提取率均沒有顯著影響。根據(jù)F值可知，4個因素對柚子皮總黃酮得率的影響順序?yàn)槌晻r間（C）>微波時間（D）>料液比（A）>乙醇濃度（B）。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design Expert 10.0.3數(shù)據(jù)分析軟件，結(jié)合模型得到最佳的柚子皮總黃酮提取工藝為料液比1∶20.61，乙醇濃度 89.81%，超聲時間 16.17 min，微波時間0.688 min。在該工藝下，柚子皮總黃酮提取率的理論值為1.464%。在料液比1∶21，乙醇濃度90%，超聲時間16 min，微波時間0.7 min條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，柚子皮總黃酮提取率平均值為1.457%，與預(yù)測值基本吻合。因此，選擇該提取條件為其最佳工藝條件。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚子皮黃酮隨料液比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在料液比較低時，隨著乙醇濃度的增加，樣品與溶劑在超聲波和微波的作用下充分接觸，黃酮較易析出。隨著料液比超過1∶20，溶劑體積的不斷增大，提取液受到超聲-微波作用強(qiáng)度減弱，提取率逐漸降低[19]；而且柚子皮中總黃酮含量是有限的，溶劑體積過大或濃度過多，提取液濃度降低，阻礙柚子皮總黃酮的提取。

研究顯示，乙醇是影響黃酮提取的重要因素。由于水的極性要強(qiáng)于乙醇，當(dāng)乙醇濃度較低時，水含量高，低濃度乙醇溶液極性較大，隨著乙醇濃度逐漸上升，乙醇溶劑的極性逐漸與柚子皮黃酮的極性接近，有利于柚子皮黃酮的溶出，因此一定范圍內(nèi)隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率呈上升趨勢。但是乙醇濃度過高時，提取劑的極性減小，從而阻礙了一部分柚子皮黃酮的溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率的降低[20]。此外，水可作為有機(jī)溶劑的傳質(zhì)劑，過高的乙醇濃度會使傳質(zhì)性降低，從而使提取率減小[21]。所以當(dāng)乙醇濃度超過80%，總黃酮提取率呈下降的趨勢。由于超聲波的作用會使物質(zhì)的細(xì)胞膜發(fā)生破裂，并能促進(jìn)分子間的運(yùn)動，因此，一定的超聲波作用能夠增加總黃酮提取率，超聲時間在10～15 min范圍內(nèi)，隨著超聲時間的延長柚子皮總黃酮提取率逐漸增加。但是超聲處理時間過長時，其熱效應(yīng)和空化效應(yīng)對黃酮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，會增加雜質(zhì)的溶出，導(dǎo)致提取率降低[15]；而超聲時間太少則造成黃酮類物質(zhì)溶解不充分，也會降低提取率，因此當(dāng)超聲時間超過15 min時，柚子皮黃酮的提取率開始降低。研究發(fā)現(xiàn)，適量微波處理，物質(zhì)吸收微波能增加，有利于有效成分的溶出，柚子皮黃酮的提取率逐漸增加；微波時間在0.5～1.0 min范圍內(nèi)，隨著微波時間的增加，柚子皮黃酮的提取率逐漸增加。當(dāng)微波時間持續(xù)增加后，微波溫度隨著微波時間的增加而升高，使部分已溶出的總黃酮類物質(zhì)揮發(fā)，導(dǎo)致有效成分出現(xiàn)損失，使總黃酮提取率降低。因此，當(dāng)微波時間持續(xù)增加超過1.0 min后，總黃酮提取率降低。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，對柚子皮總黃酮的超聲-微波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)各單因素影響柚子皮總黃酮提取率的主次順序?yàn)椋撼晻r間>微波時間>料液比>乙醇濃度。通過對柚子皮總黃酮提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，得到柚子皮總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶21，乙醇濃度90%，超聲時間16 min，微波時間0.7 min，在該工藝條件下，柚子皮總黃酮的提取率為1.457%。