骨惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)分析及地舒單抗療效觀察

王君 鮑其遠(yuǎn) 彭程 溫竣翔 沈宇輝 張偉濱 楊孝清

骨原發(fā)惡性腫瘤是一組具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其包含 50 多種病理亞型，臨床特征及生物學(xué)行為各不相同[1]。骨原發(fā)惡性腫瘤一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往對傳統(tǒng)化療及放療敏感性欠佳，缺乏有效治療手段，臨床預(yù)后較差[2-3]。近年來，隨著對腫瘤微環(huán)境研究的不斷深入，針對腫瘤微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)設(shè)計的分子靶向治療藥物相繼問世，采用靶向藥物治療進(jìn)展期難治性骨原發(fā)惡性腫瘤已成為目前國內(nèi)外臨床研究的熱點(diǎn)。

骨保護(hù)素 (osteoprotegerin，OPG)、核因子-κB受體活化因子 (receptor activator of NF-κB，RANK)及核因子-κB 受體活化因子配體 (receptor activator of NF-κB ligand，RANKL) 是近年發(fā)現(xiàn)的屬于腫瘤壞死因子家族的細(xì)胞因子。其中 RANKL 是表達(dá)于淋巴組織及成骨細(xì)胞表面的一種膜蛋白，其可通過 RANKL / RANK / OPG 信號通路活化破骨細(xì)胞(osteoclast)，加速骨質(zhì)破壞和異常吸收，導(dǎo)致骨組織發(fā)生溶骨性破壞[4]。目前已知，RANKL 也高表達(dá)于多種骨轉(zhuǎn)移性腫瘤中，RANKL / RANK / OPG 系統(tǒng)激活介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞是各種常見實體腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移并形成骨性破壞的必要條件。通過靶向阻斷RANKL 信號通路已成為目前臨床上有效治療骨轉(zhuǎn)移性腫瘤的重要方法之一[4]。然而對于骨原發(fā)惡性腫瘤，特別是其肺轉(zhuǎn)移病灶微環(huán)境內(nèi)的 RANKL 表達(dá)情況研究甚少，RANKL 在骨原發(fā)惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移中是否可作為潛在的治療靶點(diǎn)尚不得而知。本研究回顧分析了本中心骨原發(fā)惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移病灶內(nèi) RANKL表達(dá)水平及其影響因素，以觀察進(jìn)展期難治性骨原發(fā)惡性腫瘤患者接受 RANKL 抑制劑地舒單抗治療的臨床療效，探討 RANKL 在骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移中的潛在價值。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 2018 年 1 月至 2021 年 12月，在我院手術(shù)切除原發(fā)惡性骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移者；(2) 既往接受手術(shù)及正規(guī)一線治療者；(3) 原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶手術(shù)后病理檢查符合骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移者；(4)臨床資料完整，具有較好質(zhì)量的病理石蠟標(biāo)本可進(jìn)行免疫組化染色研究者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 臨床及病理資料缺失者；(2)術(shù)后病理結(jié)果證實非骨與軟組織腫瘤者；(3) 肺轉(zhuǎn)移合并肺部感染、膿胸、肺大泡或者其它嚴(yán)重肺部疾病者。

二、臨床資料及樣本

本研究為回顧性觀察性研究，相關(guān)倫理通過我院審批 (倫理編號：[ 2020 ]臨倫審第 [ 409 ]號)。

本研究共納入 39 例患者的標(biāo)本，其中 31 例骨腫瘤組織標(biāo)本，8 例原發(fā)病灶標(biāo)本。所有患者均常規(guī)接受化療聯(lián)合靶向的綜合治療。術(shù)后定期行胸部 CT、肝膽 B 超、血清腫瘤標(biāo)志物、骨手術(shù)區(qū)域 MRI 檢查，直至患者死亡或失訪。患者臨床資料包括年齡，性別，既往治療線數(shù)，既往是否接受放射治療，美國東部腫瘤協(xié)作組 (Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG) 體能狀態(tài)評分，腫瘤受累部位，標(biāo)本取材部位，病灶數(shù)量，病理類型。每次患者隨訪常規(guī)進(jìn)行肺部薄層 CT 檢查，并記錄患者的靶向治療方案、再次進(jìn)展時間、總生存期等。腫瘤病灶療效的影像學(xué)評估采用實體腫瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1 版 (RECIST 1.1)，并計算患者的疾病無進(jìn)展生存期 (progression-free survival，PFS)。PFS 定義為從復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移確診后開始接受靶向治療日期，至腫瘤進(jìn)展、死亡或最后一次隨訪日期間的時間，以先達(dá)到者為準(zhǔn)。

三、腫瘤基因表達(dá)檢測

所有腫瘤樣本委托武漢良培基因生物公司 (中國，武漢) 采用 Trizol 法提取腫瘤 RNA 并進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組建庫及二代測序 (next generation sequencing，NGS)。全轉(zhuǎn)錄組建庫采用 KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (KAPA # KK8481， Roche， 美國) 并依照說明書步驟進(jìn)行操作。首先，采用寡核苷酸探針雜交對樣本進(jìn)行 rRNA 去除，通過 PCR 合成第一鏈 (25 ℃，10 min，42 ℃，15 min，70 ℃，15 min，4 ℃，hold) 及合成第二鏈 (16 ℃，30 min，62 ℃，10 min，4 ℃，hold)。然后依次進(jìn)行接頭連接、純化及文庫擴(kuò)增并進(jìn)行文庫純化。最后使用 Qubit 2.0(ThermoFisher，美國) 對文庫進(jìn)行定量，并通過Bioanalyzer (Agilent，美國) 分析儀對文庫片段分布進(jìn)行檢測。最終采用 illumina Hiseq2500 平臺對文庫進(jìn)行雙末端長度 150 bp (PE 150) 進(jìn)行測序。測序后下機(jī)數(shù)據(jù)首先采用 cutadapt (v 1.2.1) 進(jìn)行去接頭及質(zhì)控過濾，過濾后數(shù)據(jù)采用 STAR 軟件依據(jù) Hg18版本人類參考基因組進(jìn)行比對，并通過 RSEM 軟件進(jìn)行 RNA 表達(dá)定量，結(jié)果通過 TPM (transcripts per million) 方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理分析。

由于既往缺乏骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶 RANKL 表達(dá)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究以骨腫瘤原位灶作為參考，將肺轉(zhuǎn)移灶 RANKL 表達(dá)接近骨原發(fā)病灶表達(dá)水平者稱為“中等表達(dá)”，顯著高于該水平者稱為“高表達(dá)”，而顯著低于該水平者稱為“低表達(dá)”。腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤評估及巨噬細(xì)胞表型分析采用CIBERSORT 軟件[5]。考慮到本研究中組織標(biāo)本數(shù)量有限，同時從 TARGET 數(shù)據(jù)庫 (https://ocg.cancer.gov/programs/target/projects/osteosarcoma) 中獲取88 例骨肉瘤原位病灶轉(zhuǎn)錄組 NGS 數(shù)據(jù)，從 GTex 數(shù)據(jù)庫 (www.gtexportal.org/) 獲得正常骨組織及肺組織的轉(zhuǎn)錄組 NGS 數(shù)據(jù)，作為參考對照。對于轉(zhuǎn)錄組 NGS 提示 RANKL 高表達(dá)的標(biāo)本，采用免疫組化染色進(jìn)一步驗證，并判定 RANKL 表達(dá)的主要細(xì)胞類型。免疫組化染色標(biāo)本首先經(jīng) 10% 中性甲醛固定并予以常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm 厚切片，繼而對標(biāo)本進(jìn)行蘇木精 - 伊紅染色 (HE)，同時連續(xù)切片采用 EnVision 二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所用抗體 CD68、RANKL、CD31 和 Ki67 均購自 Dako公司。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

本研究使用 SPSS 26.0 版 (IBM，紐約，美國)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分類變量采用頻數(shù)及百分比表示患者流行病學(xué)特征。使用 Spearman 方法分析連續(xù)變量間相關(guān)性，利用 Kaplan-Meier 生存曲線進(jìn)行生存分析，并用 Log-rank 檢驗分析組間差異及 95% 置信區(qū)間 (95%CI)。本研究中，RANKL 表達(dá)水平采用轉(zhuǎn)錄組二代測序結(jié)果 (TPM) 進(jìn)行定量分析，為了分析 RANKL 表達(dá)在不同臨床亞組之間表達(dá)差異，進(jìn)一步采用廣義線性回歸模型進(jìn)行單因素分析，評估不同臨床因素 (如年齡、性別、病灶數(shù)量等) 對于RANKL 表達(dá)的預(yù)測效應(yīng)值 (Beta 值)，并繪制相應(yīng)森林圖進(jìn)行亞組比較。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮到本研究樣本量相對有限，筆者認(rèn)為P值接近 0.05 可判定為接近有統(tǒng)計學(xué)意義。在評估骨惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移使用地舒單抗治療的臨床療效中，本研究參考了既往進(jìn)展期骨腫瘤歷史對照對于 PFS 進(jìn)行評估[6]，若藥物治療的中位 PFS 超過 12 周則視為具有潛在臨床療效，反之則認(rèn)為并不優(yōu)于歷史對照，臨床療效意義不明。

結(jié) 果

一、一般資料

本組 39 例中，男 27 例，女 12 例；≥ 20 歲者 17 例，< 20 歲者 22 例。病理類型包括骨肉瘤34 例，尤文肉瘤 3 例，骨未分化肉瘤 2 例。以 39 例腫瘤標(biāo)本獲取時間計算，21 例為抗血管靶向藥物治療期間 (包括阿帕替尼 17 例，帕唑帕尼 3 例，安羅替尼 1 例)，10 例為抗血管靶向藥物治療耐藥后(包括阿帕替尼 9 例，安羅替尼 1 例)，8 例無靶向治療。39 例中，21 例既往接受 1 種化療方案，16 例接受 2 種化療方案，2 例接受 3 種化療方案。除了 2 例曾接受過放療外，其余患者未接受放療。31 例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者中，24 例病灶數(shù)量超過 5 枚，其余患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶在 1～5 枚之間。39 例病灶的累及部位包括肺 (7 例)，骨與肺 (30 例)，骨及肺合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (2 例) (表1)。

表1 患者一般資料及樣本信息Tab.1 The general clinicopathological characteristics of the patients

二、骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本 RANKL 表達(dá)分析

本研究對 31 例骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本及 8 例骨腫瘤原位灶標(biāo)本進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，分析 RANKL 基因表達(dá)水平，并將分析結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)相互比較。結(jié)果提示，RANKL 在正常肺和正常骨組織中不表達(dá)，與 TARGET 數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤類似。本組病例中骨腫瘤原發(fā)病灶內(nèi) RANKL 呈較高表達(dá)，而骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移總體呈現(xiàn)低表達(dá)，少部分樣本呈現(xiàn)高表達(dá) (圖1)。標(biāo)本中 RANKL 表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞比例呈現(xiàn)顯著性正相關(guān) (R= 0.445，P= 0.004)(圖2)。本研究對骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移高表達(dá)患者的RANKL 標(biāo)本進(jìn)行免疫組化驗證，結(jié)果提示 RANKL陽性標(biāo)記細(xì)胞主要位于單核 - 巨噬細(xì)胞 (CD68 標(biāo)記)，少部分散在分布于腫瘤間質(zhì)內(nèi)，腫瘤細(xì)胞表面未見明顯 RANKL 表達(dá) (圖3)。為了進(jìn)一步觀察 RANKL 表達(dá)與腫瘤微環(huán)境內(nèi)巨噬細(xì)胞的潛在聯(lián)系，根據(jù)基因表達(dá)譜特征將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分為M0、M1、M2 3 種表型。與 RANKL 低表達(dá) (低于中位值) 組相比，RANKL 高表達(dá) (高于中位值) 組標(biāo)本中 M0 及 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤程度顯著增加 (P<0.05)，而 M1 型巨噬細(xì)胞浸潤程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.74) (圖4)。

圖1 骨原發(fā)惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)情況分析 31 例骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本、8 例骨腫瘤原位灶標(biāo)本以及公共數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤及正常對照組織的 RANKL 表達(dá)情況Fig.1 Analysis of RANKL expression of primary bone malignancy The expression of RANKL in 31 lung metastatic lesions, 8 primary lesions of bone malignancy as well as the osteosarcoma and control tissue in public database

圖2 骨原發(fā)惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)與腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of RANKL expression and intratumor macrophage infiltration in primary bone malignancy

圖3 骨原發(fā)惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)病理學(xué)觀察 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本 a (HE×200)、b (RANKL×200)、c (CD68×200) 的免疫組化(IHC) 染色，可見骨肉瘤轉(zhuǎn)移灶的瘤床區(qū)域存在明顯 CD68 (巨噬細(xì)胞) 及 RANKL 表達(dá)共定位現(xiàn)象Fig.3 Pathological evaluation of RANKL expression in primary bone malignancy The HE staining × 200 (a), and immunohistochemistry of RANKL × 200 (b), CD68 × 200 (c) in lung metastatic lesions of osteosarcoma.Co-localization of CD68 (macrophages) and RANKL was observed in the tumor bed of metastatic osteosarcoma

圖4 RANKL 高表達(dá)及低表達(dá)標(biāo)本之間腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型比較Fig.4 The phenotype comparison of tumor associated macrophages between high- and low- RANKL expression samples

三、骨腫瘤標(biāo)本 RANKL 表達(dá)的影響因素

為了進(jìn)一步明確骨原發(fā)惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)的影響因素，進(jìn)一步根據(jù)不同臨床病理學(xué)因素對患者進(jìn)行分組比較，觀察不同亞組間 RANKL 表達(dá)差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果，顯示腫瘤內(nèi)RANKL 表達(dá)在不同年齡、性別、病理類型、病灶數(shù)量以及 ECOG 評分患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，然而與靶向治療期間患者相比，靶向藥物耐藥后病灶內(nèi) RANKL 表達(dá)顯著升高 (P= 0.001)；此外，既往接受多種化療患者與僅接受一線化療者相比，病灶內(nèi) RANKL 表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢并接近差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.063)。相反，既往接受放療患者與未接受者相比，腫瘤內(nèi) RANKL 表達(dá)無明顯改變(圖5)。該結(jié)果提示，骨原發(fā)惡性腫瘤內(nèi) RANKL 升高可能與多種化療耐藥及靶向藥物耐藥有關(guān)。

圖5 骨原發(fā)惡性腫瘤 RANKL 表達(dá)根據(jù)不同臨床病理因素進(jìn)行亞組分析Fig.5 Subgroup analysis of RANKL expression in primary bone malignancy according to the clinicopathological factors

四、骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移 RANKL 抑制劑療效觀察

為進(jìn)一步明確 RANKL 抑制劑地舒單抗對于骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移是否具有臨床療效，本研究觀察了 14 例應(yīng)用地舒單抗后的 (PFS)，包括骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者10 例，骨未分化肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者 2 例，尤文肉瘤及軟骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者各 1 例。其中 8 例為抗血管靶向藥物耐藥后聯(lián)合使用地舒單抗藥物治療，6 例為地舒單抗聯(lián)合抗血管靶向藥物作為初始治療。14 例中 5 例有肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本，其中 4 例為 RANKL 高表達(dá)，1 例為 RANKL 低表達(dá)。影像學(xué)評估結(jié)果提示，地舒單抗治療在骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移總?cè)巳?(n= 14) 的中位PFS 為 2.87 個月，其中骨肉瘤患者 (n= 10) 的中位PFS 為 2.82 個月，與對照相比，其療效并無顯著臨床意義。由于本研究上述結(jié)果提示 RANKL 表達(dá)在靶向治療耐藥患者中顯著升高，本研究進(jìn)一步觀察了骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移中，靶向治療耐藥患者 (n= 8) 及RANKL 高表達(dá)患者 (n= 4) 的治療效果。本研究結(jié)果顯示，骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移靶向治療耐藥后聯(lián)合地舒單抗治療后 PFS 時間位于 2.5～11.7 個月，平均 3.5 個月 (圖6a)。在 RANKL 高表達(dá)的 4 例中，中位 PFS更是長達(dá) 8 個月，而 RANKL 低表達(dá)的 1 例 PFS 僅為 2.5 個月 (圖6b)。該結(jié)果提示 RANKL 抑制劑對于骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移患者中靶向治療耐藥患者和 RANKL高表達(dá)患者可能具有一定潛在臨床價值，其有待進(jìn)一步驗證。

圖6 骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移患者聯(lián)合 RANKL 抑制劑的療效觀察 a：7 例骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移患者發(fā)生靶向藥物耐藥后聯(lián)合 RANKL 抑制劑治療后的PFS；b：5 例骨肉類肺轉(zhuǎn)移患者病灶 RANKL 表達(dá)與臨床療效的相關(guān)性Fig.6 The efficacy of RANKL inhibitor in patients with lung metastatic bone malignancy a: The progression-free survival (PFS) of 7 patients with lung metastatic bone malignancy who developed secondary resistance to targeted agents; b: The correlation of RANKL expression and clinical efficacy in 5 patients with lung metastatic osteosarcoma

圖7 示 1 例二線化療耐藥的骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者(2 號患者) 影像學(xué)資料，抗血管靶向治療 (阿帕替尼) 前其肺部轉(zhuǎn)移灶從 1.0 cm (2018 年 7 月) 緩慢增大至 2.5 cm (2019 年 5 月)。該患者 2018 年 7 月肺部轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)后病灶免疫組化及轉(zhuǎn)錄組 NGS 結(jié)果提示 RANKL 高表達(dá)，從 2019 年 5 月起，患者在原有阿帕替尼藥物治療基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用地舒單抗120 mg 每個月，肺部病灶持續(xù)穩(wěn)定直至 2020 年 1 月(2.6 cm)，患者死于肺部感染繼發(fā)血液感染，PFS長達(dá) 8 個月。由于病例數(shù)較少，其感染發(fā)生是否與RANKL 治療有關(guān)？尚待進(jìn)一步確認(rèn)。

圖7 1 例 RANKL 高表達(dá)患者發(fā)生靶向藥物耐藥后聯(lián)合地舒單抗治療的腫瘤影像學(xué)改變。如圖中數(shù)字標(biāo)注所示，患者轉(zhuǎn)移瘤對抗血管靶向治療產(chǎn)生耐藥后于 2019 年 5 月開始聯(lián)合 RANKL 抑制劑治療，腫瘤體積穩(wěn)定無明顯進(jìn)展。2020 年 1 月患者因肺部感染去世，X 線片所示，雙肺可見多發(fā)滲出影Fig.7 The radiological evaluation of a patient of metastatic osteosarcoma with RANKL-high expression receiving RANKL inhibition therapy after developing resistance to anti-angiogenic targeted agent.As indicated by the measurement, the tumor progressed on anti-angiogenic therapy until May 2019 when RANKL inhibitor was added in combination.The tumor volumn then remained stable until the patients died of lung infection in Jan 2020.The chest X-ray demonstrated bilateral exudative change of lungs

討 論

約 30%～50% 的骨原發(fā)惡性腫瘤經(jīng)過一線治療后發(fā)生藥物抵抗及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]，臨床預(yù)后較差[8]，骨腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移目前仍缺乏有效治療措施[8]。盡管 RANKL 抑制劑對于癌癥骨轉(zhuǎn)移顯示出了一定的療效，然而，其對于骨原發(fā)惡性腫瘤是否具有抗腫瘤效果？目前尚不明確。近年來，針對血管內(nèi)皮表面的 VEGFR 的抗血管生成靶向藥物已經(jīng)對包括骨肉瘤在內(nèi)的多種骨原發(fā)惡性腫瘤顯示出一定的臨床療效[9]，然而研究表明，靶向藥物療效往往僅持續(xù)4～6 個月，靶向治療產(chǎn)生的繼發(fā)性耐藥問題是目前亟待解決的臨床難點(diǎn)[10-11]。研究表明，骨原發(fā)惡性腫瘤內(nèi)富含腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞[12]，其接受化療及抗血管靶向治療后可誘導(dǎo)形成腫瘤內(nèi)低氧環(huán)境[13]，后者可通過 Semaphorin 3A / Neuropilin-1 信號通路進(jìn)一步誘導(dǎo)并招募單核 - 巨噬細(xì)胞局部浸潤[14]，同時腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境可以改變巨噬細(xì)胞表型，使其從抗腫瘤的 M1 表型轉(zhuǎn)換為促腫瘤的 M2 表型，M2 型巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步招募免疫抑制相關(guān)的 Treg 及 Th2細(xì)胞[15]，抑制免疫激活相關(guān)的 NK 細(xì)胞及 Th1 細(xì)胞[16]，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展[17]。

以往認(rèn)為，癌癥骨轉(zhuǎn)移時，腫瘤細(xì)胞通過RANKL / RANK 信號通路激活破骨細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放溶骨性因子，誘導(dǎo)局部形成有利于腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，即“惡性循環(huán)理論”[18]。盡管有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤腫瘤內(nèi)破骨細(xì)胞含量與其腫瘤侵襲性[19]及臨床預(yù)后有關(guān)[20]，既往一項大規(guī)模臨床試驗 (OS2006 試驗) 研究結(jié)果提示，加入破骨細(xì)胞抑制藥物唑來膦酸并不能改善骨肉瘤一線化療的臨床療效[21]，據(jù)此認(rèn)為，RANKL / RANK 信號通路在骨原發(fā)惡性腫瘤中發(fā)揮的作用可能不同于骨轉(zhuǎn)移性腫瘤。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤作為最為常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，是一種富含巨噬細(xì)胞的腫瘤。米伐木肽(Mifamurtide) 作為一種非特異性的巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞激動劑，其對預(yù)防骨肉瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移顯示出了一定的臨床療效[22]，然而其對于已經(jīng)形成的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶是否同樣具有抑制作用尚不得而知。目前研究表明，靶向干預(yù)巨噬細(xì)胞表面 CD47[23]，CCL2[24]以及CSF1R[25]分子可抑制 M2 型巨噬細(xì)胞形成，而靶向干預(yù)巨噬細(xì)胞表面 IL-10[26]及 CCR5[27]分子可能誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由 M2 型向 M1 型轉(zhuǎn)化，從而起到抗腫瘤作用。盡管有研究表明，RANKL / RANK通路也可能參與了皮膚癌癥中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用[15]，然而相關(guān)研究仍處于初步階段。本研究結(jié)果顯示，RANKL 高表達(dá)患者腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞總量及 M2 型巨噬細(xì)胞顯著增加，免疫組化提示RANKL 與巨噬細(xì)胞標(biāo)記物 CD68 存在共定位現(xiàn)象，然而 RANKL 在機(jī)制上是否參與了骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的巨噬細(xì)胞調(diào)控尚有待進(jìn)一步證實。

本研究首次報道了地舒單抗可能對抗血管靶向治療繼發(fā)耐藥后的骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移具有一定臨床療效。既往文獻(xiàn)曾報道 1 例索拉菲尼聯(lián)合地舒單抗治療骨肉瘤脊柱轉(zhuǎn)移有效的病例報道[28]，然而由于肺是骨肉瘤轉(zhuǎn)移最為常見的靶器官，該病例的治療經(jīng)驗?zāi)芊裢茝V至骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移仍值得商榷。本研究納入的 14 例骨腫瘤患者均有肺轉(zhuǎn)移，接受 RANKL 抑制劑地舒單抗治療后，本研究結(jié)果顯示，對于抗血管靶向治療耐藥后加入 RANKL 抑制劑，進(jìn)行聯(lián)合治療可能逆轉(zhuǎn)靶向藥物耐藥，通過潛在協(xié)同作用推遲轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)展。其機(jī)制可能與靶向藥物繼發(fā)耐藥后局部 RANKL 表達(dá)升高以及 M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞增加有關(guān)。此外，本研究結(jié)果顯示骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移病灶的 RANKL 表達(dá)具有較大的患者間異質(zhì)性，其在大部分患者中表現(xiàn)為低表達(dá)，而其在少數(shù)患者中可呈現(xiàn)高表達(dá)，甚至超過骨原發(fā)病灶，該現(xiàn)象可能解釋了為何 RANKL 抑制劑對于骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移患者總體人群療效欠佳，但部分患者的療效顯著 (圖6)。本組發(fā)現(xiàn) 4 例肺轉(zhuǎn)移灶 RANKL 高表達(dá)的患者對地舒單抗聯(lián)合治療均顯示出較為理想的臨床療效，而 1 例RANKL 低表達(dá)患者療效不佳。該現(xiàn)象提示肺轉(zhuǎn)移病灶內(nèi) RANKL 表達(dá)情況可能是地舒單抗敏感性的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) RANKL 在骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本中呈現(xiàn)總體低表達(dá)，少部分高表達(dá)趨勢。病灶內(nèi) RANKL 高表達(dá)與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤水平有關(guān)。與骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移患者總體相較而言，抗血管靶向藥物耐藥及病灶 RANKL 高表達(dá)的患者亞組可能是 RANKL 抑制劑治療敏感的優(yōu)勢人群。須指出的是，由于本組病例樣本量較小，該結(jié)論尚待大規(guī)模研究進(jìn)一步確認(rèn)；此外，RANKL 抑制劑對于骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移病灶靶向藥物耐藥產(chǎn)生療效的潛在機(jī)制值得進(jìn)一步研究。