BRD9調(diào)控NLRP3炎性小體激活在急性腎損傷的作用和機(jī)制研究

陳秋菊 徐振健 周鑫 羅廣軒 徐安平

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是住院患者常見(jiàn)的急重癥之一，主要特點(diǎn)是腎功能的急劇下降［1］，其常見(jiàn)病因是腎臟缺血或腎毒性物質(zhì)損害腎臟等。醫(yī)院內(nèi)獲得性AKI 病死率可高達(dá)50%。目前，透析是AKI 目前唯一有效的干預(yù)措施。因此，深入探索AKI 的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效治療方法，對(duì)改善患者臨床預(yù)后至關(guān)重要。

各種測(cè)序技術(shù)及數(shù)據(jù)挖掘工具的出現(xiàn)，為全面理解AKI 的發(fā)病機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。其中，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）和隨機(jī)森林算法（random forest algorithm，RFA）可以實(shí)現(xiàn)基因與疾病性狀的良好結(jié)合，實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵基因的識(shí)別。同時(shí)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了基于細(xì)胞層面的功能注釋和分子機(jī)制研究。盡管這些技術(shù)在腫瘤、阿爾茨海默病、糖尿病腎病等已經(jīng)得到了很好的實(shí)踐［2］，但在AKI 中的應(yīng)用較為缺乏。

本研究通過(guò)對(duì)Gene Expression Omnibus（GEO）下載的AKI 測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE139061 和GSE139506 進(jìn)行二次分析，發(fā)現(xiàn)BRD9 可能是AKI發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因，并且高表達(dá)于巨噬細(xì)胞。同時(shí)在AKI 中，巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能富集于炎癥信號(hào)及炎性小體激活相關(guān)通路?；贚PS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化模型發(fā)現(xiàn)，抑制BRD9，減弱了NF-kB 蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制了NLRP3 炎性小體的激活和炎癥因子的釋放，提示BRD9 可以作為AKI 治療的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及差異基因篩選從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并下載人的AKI 數(shù)據(jù)集：GSE139061；以及小鼠腎臟組織單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集：GSE139506。使用edgeR 包分析GSE139061 數(shù)據(jù)集中正常與病變組織中的差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)是adjustedP＜0.05，|log FC|＞1；使用“ggplot2”包繪制火山圖；“clusterProfiler”包完成GO 和KEGG 富集分析。使用“Seurat”包對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集GSE139506 進(jìn)行分析。

1.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)“WGCNA”包完成數(shù)據(jù)集GSE139061 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將表達(dá)模式近似的基因歸屬于同一個(gè)模塊。同時(shí)計(jì)算每個(gè)模塊與疾病狀態(tài)（是否發(fā)生AKI）的關(guān)聯(lián)程度，將關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的模塊用于后續(xù)hub 基因的篩選［2］。通過(guò)Draw Venn Diagram 軟件，將與疾病性狀關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的hub 基因與DEGs 取交集，用于后續(xù)分析。

1.3 隨機(jī)森林篩選關(guān)鍵基因通過(guò)“randomForest”包對(duì)WGCNA 分析hub 基因和DEGs 的交集數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因重要性評(píng)估。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，使用普賽諾公司的RAW264.7 專用培養(yǎng)基，放置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。使用脂多糖LPS 1000 ng/μL 刺激細(xì)胞24 h 誘導(dǎo)Raw264.7 細(xì) 胞M1 分 化；LPS 刺 激 前1h 使 用BRD9 選擇性抑制劑GSK602 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。

1.5 RNA 提取及RT-qPCR 檢測(cè)使用PBS 洗滌2 遍細(xì)胞后，采用Trizol Reagent 法提取總RNA，并按照說(shuō)明書完成逆轉(zhuǎn)錄；隨后采用RT-qPCR 法測(cè)定抑制劑GSK602 對(duì)BRD9 的抑制效率。

1.6 Western Blot 檢測(cè)去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2 次，加入RIPA 試劑后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程完成蛋白提取、濃度測(cè)定、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜及抗體孵育，最后使用ECL 法顯現(xiàn)目的條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25.0 及Graphpad 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。組間比較采用方差分析，以P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因篩選及功能富集分析GSE139061數(shù)據(jù)集獲得397 個(gè)DEGs，其中247 個(gè)上調(diào)，150 個(gè)下調(diào)（圖1A）。GO 富集分析結(jié)果提示，分子功能主要富集于腎臟發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞趨化、急性炎癥反應(yīng)、RNA 剪切及乙酰輔酶A 代謝等（圖1B）；KEGG富集分析結(jié)果提示，差異基因主要富集于鈣離子信號(hào)通路、HIF-1 和Hippo 信號(hào)通路以及三羧酸循環(huán)通路等（圖1C）。

圖1 差異基因篩選及功能富集分析。A：差異基因的火山圖。B：差異基因的GO 分析。C：差異基因的KEGG 分析。

2.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于數(shù)據(jù)集GSE139061，使用WGCNA 法，首先篩選最佳軟閾值，結(jié)果如圖2A 所示，當(dāng)軟閾值取7 時(shí)可獲得較好的連接關(guān)系。將基因進(jìn)行模塊化富集分析，結(jié)果如圖2B 所示。將不同模塊與疾病性狀關(guān)聯(lián)，得到結(jié)果如圖2C 所示。選擇關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的MEblue 進(jìn)行分析，提取其中的46 個(gè)基因作為hub 基因。

圖2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。A：無(wú)標(biāo)度擬合指數(shù)分析和平均連接性分析。B：基因簇樹(shù)狀圖。圖中每個(gè)分支代表一個(gè)基因，下面的每種顏色代表一個(gè)共表達(dá)模塊。C：模塊-特征關(guān)系的熱圖。藍(lán)色模塊與AKI 顯著相關(guān)。

2.3 關(guān)鍵基因篩選將DEGs 結(jié)果與WGCNA 所得hub 基因，用Draw Venn Diagram 軟件取交集，得到28 個(gè)關(guān)鍵基因（圖3A）。采用RFA 法對(duì)28 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行重要性排序，得到結(jié)果如圖3B 所示。我們發(fā)現(xiàn)，其中BRD9 排序靠前，并且與巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放調(diào)控緊密相關(guān)［3，4］。

圖3 篩選關(guān)鍵基因。A：韋恩圖。B：隨機(jī)森林關(guān)鍵基因篩選。

2.4 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析為了進(jìn)一步探索AKI 發(fā)病過(guò)程中BRD9 的角色，我們分析了小鼠來(lái)源的AKI單細(xì)胞數(shù)據(jù)集GSE139506。UMAP 聚類得到包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的12 群細(xì)胞（圖4A），我們發(fā)現(xiàn)，AKI發(fā)生后，BRD9 高表達(dá)于巨噬細(xì)胞，且隨著時(shí)間的推移，表達(dá)逐漸增加（圖4B）。針對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)功能主要富集在白介素反應(yīng)、趨化因子介導(dǎo)的反應(yīng)、ERK1 及ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)、巨噬細(xì)胞遷移、腫瘤壞死因子的分泌等（圖4C）；KEGG 富集分析結(jié)果顯示，主要參與趨化因子信號(hào)通路、IL-17 和腫瘤壞死因子相關(guān)信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、NOD 樣受體和NF-kB 信號(hào)通路（圖4D）。

圖4 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析。A：UMAP 可視化。B：BRD9 在巨噬細(xì)胞的表達(dá)量分析C：GO 富集分析。D：KEGG 富集分析。

2.5 BRD9 通過(guò)NF-kB 影響NLRP3 炎性小體的激活，調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放使用BRD9 選擇性抑制劑GSK602 0.5 μM 預(yù)處理LPS 刺激的Raw264.7細(xì)胞，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，抑制BRD9 蛋白的表達(dá)顯著降低p65、NLRP3、IL-1β 和IL-18 的蛋白表達(dá)水平（圖5A-B）。

圖5 BRD9 通過(guò)NF-kB 影響NLRP3 炎性小體的激活。A：BRD9 的mRNA 表達(dá)水平（n=3）。B：蛋白免疫印跡檢測(cè)NLRP3 炎癥小體激活相關(guān)蛋白表達(dá)的代表圖（n=3）。

3 討 論

盡管人們對(duì)于AKI 的認(rèn)識(shí)不斷加深，但治療手段仍然非常有限，由此帶來(lái)的急性腎衰竭以及隨之而來(lái)的高致死率亟待解決。本研究通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù) 集GSE139061 進(jìn) 行DEGs 分 析、WGCNA 分 析 和RFA 分析，同時(shí)結(jié)合對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集GSE139506的分析，發(fā)現(xiàn)了AKI 干預(yù)新的潛在靶點(diǎn)；機(jī)制上，BRD9 通過(guò)NF-kB 影響巨噬細(xì)胞NLRP3 炎性小體的激活調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，從而影響AKI 的疾病進(jìn)程。

腎小管損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和代謝紊亂、是AKI 發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［5］。在AKI 的早期階段，壞死的腎小管上皮細(xì)胞形成了一個(gè)富含DAMP 的間質(zhì)微環(huán)境，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為促炎表型，導(dǎo)致大量促炎巨噬細(xì)胞募集在損傷的腎臟中，加重腎臟損傷［6］。IL-1β 和IL-18 是促炎巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，可進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)無(wú)菌性炎癥［6］。NLRP3 炎性小體在巨噬細(xì)胞激活并分泌炎癥介質(zhì)IL-1β 和IL-18 的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［6］。因此，阻斷NLRP3 的激活可能會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的激活，減少AKI 早期的炎癥壞死。同時(shí)，現(xiàn)有研究表明，通過(guò)不同的手段抑制NLRP3炎性小體的異常激活可以極大增強(qiáng)線粒體呼吸鏈的功能，降低巨噬細(xì)胞IL-1β 的產(chǎn)生，從而有效緩解小鼠AKI 的發(fā)生發(fā)展［7］。

BRD9 屬于溴結(jié)構(gòu)域蛋白大家族，是SWI/SNF（BAF）染色質(zhì)重塑復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，能夠與乙酰化和/或丁?；慕M蛋白結(jié)合，依賴ATP 的方式改變核小體內(nèi)的DNA-組蛋白接觸，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在腫瘤細(xì)胞增殖、多能性和炎癥調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用［8］。Hargreaves 等人也發(fā)現(xiàn)［3］，在未受刺激的巨噬細(xì)胞中，BRD9 與BRD4 結(jié)合，并在受到刺 激 后BRD9 與STAT1、STAT2 和IRF9 共同招募至干擾素刺激基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)干擾素的表達(dá)；BRD9 可能成為抑制干擾素相關(guān)炎癥的潛在靶點(diǎn)。本研究中，我們進(jìn)一步驗(yàn)證BRD9是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞NLRP3 炎性小體功能參與AKI 的發(fā)生發(fā)展。體外細(xì)胞模型結(jié)果表明，BRD9抑制劑處理后，p65、NLRP3、IL-1β、IL-18 的蛋白表達(dá)水平顯著下降，提示BRD9 干擾可以抑制巨噬細(xì)胞炎性小體異常激活及限制下游炎癥因子的釋放，進(jìn)而緩解AKI 的發(fā)生發(fā)展。