二氧化鈦納米顆粒對小鼠胚胎發(fā)育的作用及其機(jī)制探討

羅鶯兒 郭義紅 梁婷 張靜 陳慧*

納米技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，據(jù)報道口服暴露于納米顆粒（NPs）后，NPs 會積聚在心、肝、脾、肺、腎等地方，并擾亂小鼠和大鼠的葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)［1，2］。TiO2NPs 作為食品添加劑（歐洲為E171）已被廣泛應(yīng)用于脫脂牛奶和糖果等食品的生產(chǎn)過程。在離體胎盤灌注模型中，已發(fā)現(xiàn)所有胎盤組織和50%的胎糞樣品中都存在Ti，表明TiO2NPs 可能存在母胎轉(zhuǎn)移［1，2］。E171 是由銳鈦礦和/或金紅石型組成的TiO2NPs 粉末，平均粒徑為104.9±44.9 nm［1］。據(jù)推測，納米顆粒的作用取決于它們的大小、形態(tài)、遷移速率和消耗量，目前尚無研究充分探索平均粒徑100 nm 的TiO2NPs 對母胎健康的風(fēng)險［2］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物3 周齡的C57BL/6J 小鼠，雌性32只，雄性16 只，均購自中山大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動物中心東校園）（生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2021-0029），并飼養(yǎng)于中山大學(xué)動物中心的SPF 級環(huán)境中（使用許可證號SYXK（粵）2020-0107）。所有動物實(shí)驗(yàn)都得到了動物保護(hù)和使用委員會的批準(zhǔn)（2022-015）。

1.2 試劑TiO2NPs（粒徑100 nm，銳鈦，親水，上海麥克林生化科技股份有限公司，中國）；兔抗小鼠NF-κB p65 抗體（Abcam，英國）；兔抗小鼠β-Actin 抗體（CellSignaling Technology，美國）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（BS10950，Bioworlde，中國）；RIPA 裂解緩沖液（P0013B，碧云天，中國）；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（P1045，碧云天，中國），BCA 蛋白測定試劑盒（CW0014S，康為世紀(jì)，中國）。

1.3 儀器純水機(jī)（Spring-S40L，中國）；精密移液槍（Eppendorf 公司，德國）；超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT，新芝生物，中國）；冷凍研磨機(jī)（JXFSTPRPCL，上海凈信）。

1.4 分組及處理將小鼠飼養(yǎng)8 周齡后，隨機(jī)分為4 組，即正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8 只雌鼠，按照雌鼠：雄鼠=2∶1 的比例合籠。第二天檢查雌鼠陰栓存在記為GD0.5，自GD0.5 起至GD17.5 天，分別灌胃給予0 mg/kg/d、10 mg/kg/d、50 mg/kg/d、250 mg/kg/d 的TiO2NPs，劑量設(shè)置基于先前研究［3］。為獲得均勻的懸浮液，在配制后在超聲波清洗機(jī)中震蕩30 分鐘。

1.5 組織收集在GD17.5 時對母鼠實(shí)施安樂死，解剖母鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮，仔細(xì)分離胎盤、胎鼠組織，拍照及稱重記錄后組織標(biāo)本在-80℃下保存供進(jìn)一步分析。

1.6 組織勻漿及蛋白定量整塊胎鼠組織按1∶9的重量體積比，加入RIPA 裂解緩沖液于冷凍研磨機(jī)中充分裂解，4℃條件下12 000 rpm 離心30 min后收集上清。使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度后，將蛋白定量至每組總蛋白60 μg。

1.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后裁剪條帶，按照說明書指示將稀釋后的兔抗小鼠NF-κB P65 抗體和兔抗小鼠β-Actin 抗體分別作為一抗，在4℃條件下過夜孵育相應(yīng)條帶。按照說明書指示用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 作為二抗與上述一抗結(jié)合，室溫?fù)u床緩慢搖動孵育1～2小時。以β-Actin 作為內(nèi)參對照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)采用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)采用GraphPad8.0.2 分析處理。各組檢測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±SD）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各處理組與正常對照組均值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TiO2NPs 對妊娠小鼠體重的影響見圖1，隨著TiO2NPs 給藥劑量增加，GD17.5 時妊娠母鼠體重呈輕微降低趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 GD17.5 時TiO2NPs 各劑量組母鼠的體重（n≥7）

2.2 GD17.5 時TiO2NPs 各劑量組母鼠的器官系數(shù)見圖2，與對照組相比，TiO2NPs 高劑量組肝器官系數(shù)顯著降低（P＜0.05）（圖2 B），而各劑量組心、脾、肺、腎、腦的器官系數(shù)，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2 A，C-F）。

圖2 GD17.5 時TiO2NPs 各劑量組母鼠的器官系數(shù)

2.3 胎鼠大體外觀形態(tài)見圖3，相對于對照組，其他各劑量組隨TiO2NPs 給藥劑量增加，出現(xiàn)異常胎鼠比例增多，胎鼠發(fā)育不良，體型偏小，呈現(xiàn)胎兒生長受限趨勢（圖3）。

圖3 四組胎鼠大體外觀形態(tài)

2.4 胎鼠中NF-κB 蛋白水平升高見圖4，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)條帶圖（圖4 A）顯示，隨著TiO2NPs劑量增多，胎鼠中NF-κB 蛋白水平呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。相比于對照組，高劑量組（P＜0.05）NF-κB蛋白水平相對定量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）。

圖4 各劑量組胎鼠的NF-κB 蛋白水平

3 討 論

體重和器官系數(shù)是實(shí)驗(yàn)中常用的觀察終點(diǎn)指標(biāo)，綜合反映動物機(jī)體中毒效應(yīng)［4-6］。器官系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；器官系數(shù)減小，則表示臟器萎縮及其他退行性改變等［7］。在本研究中TiO2NPs 各處理組妊娠母鼠的體重呈稍降低趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，TiO2NPs 高劑量組肝器官系數(shù)顯著升高。這與先前研究一致，據(jù)報道小鼠經(jīng)口暴露TiO2NP會引起肝炎細(xì)胞浸潤和肝纖維化，這可能與NFκB 上調(diào)有關(guān)，并通過TGF-β/Smads/MAPK/Wnt 信號通路介導(dǎo)［8，9］。相比于對照組，雖然TiO2NPs 各處理組心、脾、肺、腎、腦的器官系數(shù)，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但心、脾器官系數(shù)呈現(xiàn)倒U 形的劑量-反應(yīng)關(guān)系，即低劑量升高，高劑量降低的趨勢，這是生物適應(yīng)環(huán)境壓力源（例如重金屬，有機(jī)污染物，有毒代謝物）的一種負(fù)反饋非特異性適應(yīng)。施加任何負(fù)荷都會迫使系統(tǒng)更加努力地工作，并增加代謝成本以抵消負(fù)荷，從而保持健康，但在矯枉過正期間，這種變化會被觀察到性能增強(qiáng)，但這些壓力源最終會對穩(wěn)態(tài)過程造成改變或破壞［10］。

Ling Chen 等的研究表明，隨著TiO2NPs［粒徑（10±25）nm］暴露劑量增加，妊娠期糖尿?。℅DM）小鼠血糖水平顯著升高，體重進(jìn)一步下降，可檢測到胎盤和胎鼠中Ti 含量的積累，這可能進(jìn)一步損害GDM 小鼠的胎盤結(jié)構(gòu)，從而加劇胎兒發(fā)育異常（如胎兒體長、尾長、體重等數(shù)值下降，異常胎兒數(shù)量增多）。NF-κB 通路在炎癥和免疫，以及胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要，NF-κB 激活使IL-6、TNF 和CXCL2 等炎癥因子表達(dá)增加［11］。據(jù)報道E171 破壞小鼠血睪屏障，誘導(dǎo)炎癥，并引起生精小管中的生殖細(xì)胞脫落［12］。在本研究中，隨著口服暴露TiO2NPs 劑量增加，胎鼠中NF-κB P65 蛋白表達(dá)水平顯著升高，且異常胎鼠增多，可能與TiO2NPs 介導(dǎo)胎鼠炎癥反應(yīng)有關(guān)。

因此，TiO2NPs 可能透過小鼠母胎屏障，產(chǎn)生一定的炎癥效應(yīng)，但未來仍需更多研究確定TiO2NPs 造成母胎損傷部位及機(jī)制。