獼猴桃膏藥病病原菌初步鑒定及防治建議

王麗　朱佳紅　侯琿　黃天祥　袁洪波　涂洪濤

摘 要：為了初步明確獼猴桃膏藥病的病原菌，通過(guò)病害癥狀觀(guān)察、病原菌形態(tài)特征觀(guān)察和分子技術(shù)測(cè)序分析對(duì)獼猴桃膏藥病進(jìn)行了病原菌鑒定。根據(jù)病害癥狀特征、病原菌形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起獼猴桃膏藥病的病原菌初步鑒定為假柄隔擔(dān)菌Septobasidium pseudopedicellatum。同時(shí)對(duì)病原菌的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了討論，并對(duì)膏藥病防治措施予以闡述，以期為獼猴桃膏藥病的研究和防治提供參考。

關(guān)鍵詞：獼猴桃膏藥?。徊≡b定；假柄隔擔(dān)菌；防控措施

獼猴桃因富含多種微量元素、維生素C和多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而廣受大眾歡迎。獼猴桃在原產(chǎn)地中國(guó)，約從20世紀(jì)70年代起被當(dāng)作經(jīng)濟(jì)果樹(shù)進(jìn)行種植，在“七五”和“八五”被列為重點(diǎn)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目后，才先后于湖南、湖北、浙江、江蘇、陜西、安徽及河南等地區(qū)大面積種植[1]。然而，氣候、環(huán)境和生產(chǎn)方式的變化導(dǎo)致了各種病害的傳播，這些病害導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)衰弱，嚴(yán)重影響果品產(chǎn)量和質(zhì)量。至今，報(bào)道較多的引起獼猴桃病害的病原菌有獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病、葉斑病、灰霉病、軟腐病和青霉病等。然而，由擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱隔擔(dān)子菌目隔擔(dān)子菌科的隔擔(dān)菌屬（Septobasidium）引起的膏藥病[2]，是一種在板栗、柑橘等多種果樹(shù)上的常見(jiàn)病害[3-4]，近年來(lái)在我國(guó)黃河流域以南以及長(zhǎng)江流域各獼猴桃產(chǎn)地屢見(jiàn)發(fā)生，但是關(guān)于其病原菌的深入研究鮮有報(bào)道。針對(duì)這種情況，筆者對(duì)獼猴桃膏藥病的活體病樣進(jìn)行癥狀及顯微形態(tài)觀(guān)察并結(jié)合分子技術(shù)測(cè)序分析，明確其病原菌種類(lèi)。并對(duì)膏藥病的發(fā)病規(guī)律及防治措施等予以闡述，以期為獼猴桃生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

病樣采自湖南省永順縣獼猴桃產(chǎn)區(qū)，屬于中亞熱帶山地濕潤(rùn)氣候，四季分明，熱量較足，雨量充沛，溫暖濕潤(rùn)。

1.2 病原菌形態(tài)觀(guān)察

直接挑取病樣上的干凈病原菌，置于顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)特征。

1.3 病原菌分子鑒定

將病原菌直接從病部刮下來(lái)裝在滅過(guò)菌的1.5毫升離心管中，用真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。用真菌通用引物ITS1和ITS4 [5]擴(kuò)增DNA，50 微升反應(yīng)體系包括：PCR Buffer 5微升，dNTP 1微升，ITS4和ITS1引物各2 微升，Taq DNA聚合酶0.4微升，DNA 1微升，ddH2O 38.6微升。反應(yīng)程序：94 ℃ 5分鐘；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72 ℃ 40秒，循環(huán)30次，72 ℃ 10分鐘。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，得到與其序列同源性較高的相關(guān)菌株的序列，采用MEGA11軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步確定病原菌的種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣采集

筆者于2021年對(duì)該地的獼猴桃果園進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)并采集了附著灰白色膏藥狀病斑的獼猴桃枝干（圖1）。病菌在樹(shù)皮層或韌皮部寄生，病部長(zhǎng)出一層較厚的菌膜，像膏藥一樣緊貼在樹(shù)體主干或枝干上。病斑較大，通常直徑或長(zhǎng)度能達(dá)到3～11厘米。病原菌能夠侵入皮層危害，導(dǎo)致樹(shù)體生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重的造成樹(shù)干枯死。病癥與隔擔(dān)菌屬Septobasi-dium真菌引起的膏藥病癥狀一致。

2.2 病原菌形態(tài)特征

膏藥病菌形成連續(xù)的、緊致的子實(shí)層，初呈白色，后期視溫濕度不同而轉(zhuǎn)呈灰白色或保持白色，衰老時(shí)易龜裂脫落（圖1，圖2）；子實(shí)層由不規(guī)則排列或者垂直向上的菌絲和擔(dān)子組成（圖3，圖4）。

2.3 病原菌分子鑒定

應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)直接提取的病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)有一條特異性好的擴(kuò)增條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，獼猴桃膏藥病菌（MHT1）與假柄隔擔(dān)菌Septobasidium pseudopedicellatum位于同一個(gè)發(fā)育樹(shù)分支，進(jìn)化距離最近（圖5）。因此，根據(jù)病害癥狀特征、病原菌形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起獼猴桃膏藥病的病原菌初步鑒定為假柄隔擔(dān)菌Septobasidium pseudopedicellatum。

3 討 論

近年來(lái)，不斷有研究者報(bào)道由隔擔(dān)菌屬引起的果樹(shù)膏藥病，如核桃、柑橘、板栗及獼猴桃等樹(shù)種的膏藥病。對(duì)癥狀進(jìn)行描述的報(bào)道居多，然而，對(duì)于引起這些膏藥病的病原菌卻鮮少進(jìn)行研究，關(guān)于獼猴桃膏藥病僅張力田等[6]報(bào)道在獼猴桃病枝條上發(fā)現(xiàn)膏藥病病斑。筆者首次應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)合分子技術(shù)測(cè)序?qū)J猴桃膏藥病的病原菌初步鑒定為假柄隔擔(dān)菌Septobasidium pseudopedicellatum。明確了病原菌的種類(lèi)，能夠?yàn)樵摬〉挠行Х乐翁峁├碚撘罁?jù)。

目前沒(méi)有關(guān)于Septobasidium pseudopedicellatum致病性驗(yàn)證的報(bào)道，筆者在本研究中也沒(méi)有培養(yǎng)出病原菌，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步深入研究。由于膏藥病病原菌子實(shí)體的形狀和厚度各不相同，因此很難鑒定到種[7]，故而筆者在本研究中采用形態(tài)特征結(jié)合分子技術(shù)初步將之鑒定為假柄隔擔(dān)菌。雖然筆者對(duì)病原菌進(jìn)行了初步鑒定，但是后續(xù)研究還有待深入。

4 獼猴桃膏藥病的防控建議

4.1 加強(qiáng)病原菌相關(guān)基礎(chǔ)性研究

雖然國(guó)內(nèi)研究報(bào)道由隔擔(dān)菌屬真菌引起的膏藥病，給多種果樹(shù)的生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響，然而關(guān)于導(dǎo)致這種病害的病原菌自身的認(rèn)識(shí)卻不深入。對(duì)于其發(fā)病規(guī)律的調(diào)查表明膏藥病以菌絲體在病枝或病葉上越冬，翌年春季溫濕度合適時(shí)擔(dān)孢子通過(guò)風(fēng)雨傳播，也可通過(guò)蚜蟲(chóng)、鳥(niǎo)類(lèi)等進(jìn)行傳播。長(zhǎng)江及黃淮河流域部分地區(qū)5—7月或9—10月高溫多雨季節(jié)發(fā)病嚴(yán)重[8]。介殼蟲(chóng)和蚜蟲(chóng)發(fā)生重，通風(fēng)不良，果園管理粗放，發(fā)病嚴(yán)重。然而，隔擔(dān)菌屬類(lèi)真菌危害果樹(shù)與介殼蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)有關(guān)，作用機(jī)制較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步深入研究。而加強(qiáng)獼猴桃膏藥病菌的基礎(chǔ)性研究，加強(qiáng)預(yù)防，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)，提高樹(shù)體抗性，對(duì)防治獼猴桃膏藥病能夠起到事半功倍的作用。

4.2 建立科學(xué)的防控體系

獼猴桃膏藥病近年來(lái)有發(fā)展嚴(yán)重的趨勢(shì)，迫切需要建立科學(xué)的防控技術(shù)體系。依據(jù)獼猴桃膏藥病的發(fā)生規(guī)律，在貫徹“預(yù)防為主，綜合防治”植保方針的基礎(chǔ)上，筆者建議構(gòu)建基于植物檢疫、物理防治、化學(xué)防治和生物防治協(xié)調(diào)應(yīng)用的綜合防控技術(shù)體系。

首先，把好檢疫關(guān)。介殼蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)和葉蟬等同翅目害蟲(chóng)的發(fā)生有利于膏藥病的發(fā)生和擴(kuò)展及蔓延，可隨苗木運(yùn)輸、接穗傳播。因此，要加強(qiáng)引種苗木調(diào)運(yùn)過(guò)程中的植物檢疫，禁止攜帶病蟲(chóng)的苗木進(jìn)入，阻礙病蟲(chóng)害進(jìn)一步傳播蔓延，預(yù)防和保護(hù)安全區(qū)的獼猴桃健康生長(zhǎng)。然后，應(yīng)用物理防治方法。培育實(shí)生苗，科學(xué)合理地配置株行間距，建立通風(fēng)透光和抗病能力強(qiáng)的實(shí)生苗園地。適時(shí)刮除感病部位的病斑病膜，砍伐染病的獼猴桃植株、枝干及長(zhǎng)勢(shì)較弱的老弱病植株，集中銷(xiāo)毀，預(yù)防再侵染，合理更新果園。

其次，利用化學(xué)藥劑。殺蟲(chóng)可選用噻蟲(chóng)嗪、高效氯氰菊酯、氟啶蟲(chóng)胺腈及噻嗪酮等內(nèi)吸性強(qiáng)的殺蟲(chóng)劑。防病，可先將病斑菌膜刮除，然后用石硫合劑、波爾多液、甲基硫菌靈或戊唑醇等藥液涂抹病斑。也可在發(fā)病前或發(fā)病初期，全樹(shù)噴施甲基硫菌靈、多菌靈、腈菌唑或戊唑醇等藥劑，抑制病菌侵染。再次，使用生物防治技術(shù)。在天敵盛發(fā)期（5—6月）盡可能避免使用廣譜性殺蟲(chóng)劑，以減少對(duì)天敵的殺傷力，保護(hù)利用黑緣瓢蟲(chóng)、紅點(diǎn)唇瓢蟲(chóng)、二星瓢蟲(chóng)、草蛉、蠟蚧跳小蜂、姬小蜂等天敵以防治介殼蟲(chóng)及蚜蟲(chóng)等害蟲(chóng)。

參考文獻(xiàn)

[1]? 王麗，周增強(qiáng)，侯琿，等. 我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究分析及防控[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)，2017，46（2）：178-182.

[2]? 唐永奉，閆大琦，楊建榮，等. 5種藥劑防治核桃膏藥病藥效試驗(yàn)[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，2014，43（4）：128-131.

[3]? 王倫. 板栗膏藥病發(fā)病規(guī)律及防治技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（12）：143.

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基金項(xiàng)目：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2022-ZFRI）;長(zhǎng)江獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心（CJZX20210109）。

作者簡(jiǎn)介：王麗，女，漢族，河南正陽(yáng)人，博士，助理研究員，主要從事果樹(shù)病害防控研究工作。E-mail：wangli06@caas.cn