乙腈和甲酸含量對豬肉和雞蛋中獸藥殘留回收率的影響

李曉芹　方志娟　王偉　金萍　張玲　丁洪流

摘要［目的］探索提取液中不同含量的乙腈、甲酸對豬肉、雞蛋中磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類獸藥殘留回收率的影響。［方法］采用70%、80%、90%、100%乙腈溶液及含0.1%、0.2%、0.5%、1.0%甲酸的90%乙腈溶液分別進行提取，比較共提物含量差別；通過外源加標回收試驗，評價不同含量的乙腈和甲酸對豬肉和雞蛋樣品中獸藥殘留回收率的影響。［結果］增加乙腈比例和降低甲酸含量可以減少共提取量，但100%乙腈溶液會容易造成樣品結塊，建議采用90%乙腈溶液作為提取液。酸化的乙腈溶液利于磺胺類藥物的提取，90%乙腈利于四環(huán)素類藥物的提取，對部分喹諾酮類藥物具有明顯的基質增強作用。［結論］在選擇提取條件時，應根據(jù)檢測需求選擇合適的提取溶液，應注意可能存在基質作用，需進一步凈化以準確定量。

關鍵詞乙腈；甲酸；提?。回i肉；雞蛋；獸藥殘留；回收率

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0190-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.044開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Acetonitrile and Formic Acid Contents on the Recovery Rate of Veterinary Drug Residues in Pork and Eggs

LI Xiao-qin， FANG Zhi-juan， WANG Wei et al（Suzhou Inspection for Food and Testing Center， Suzhou， Jiangsu 215104）

Abstract［Objective］To explore the effects of different acetonitrile and formic acid contents on the recovery rate of veterinary drug residues of sulfonamides， tetracyclines and quinolones in pork and eggs. ［Method］Pork and egg samples were extracted with acetonitrile-water ratios of 70%， 80%， 90%， 100% and 90% acetonitrile solution containing 0.1%， 0.2%， 0.5%， 1.0% formic acid， respectively.Differences in co-extraction contents were compared. Spike recovery test to evaluate the effect of different ratios of acetonitrile and formic acid on the recovery of veterinary drug residues in pork and egg samples.［Result］ Increasing the proportion of acetonitrile and reducing the content of formic acid could reduce the co-extraction amount of impurities， but 100% acetonitrile was easy to cause agglomeration. It was recommended to use 90% acetonitrile solution as the extraction solution. The acidified acetonitrile solution was beneficial to the extraction of sulfonamides， 90% acetonitrile was beneficial to the extraction of tetracyclines， and had obvious matrix enhancement effect on some quinolones. ［Conclusion］When selecting extraction conditions， an appropriate extraction solution should be selected according to the detection requirements.There may be matrix effects during multi-residue detection. Further purification is required to accurate quantificate.

Key wordsAcetonitrile;Formic acid;Extraction;Pork;Egg;Veterinary drug residues;Recovery rate

近年來市場監(jiān)管局對動物源性農產品質量安全的監(jiān)管力度不斷加大。動物源性農產品基質復雜，富含蛋白質、脂肪、糖等成分，干擾獸藥殘留物的提取和凈化。而獸藥殘留量含量甚微、極性差別大［1-2］。無論是蛋白質或脂肪的分離去除過程，還是待測液的定性和定量，都給實驗室痕量檢測提出了更高要求［3］。目前，動物源性農產品中獸藥殘留檢測多依托于液質聯(lián)用分析技術［4-5］。液質聯(lián)用儀對待測液清潔度要求較高，需要雜質含量盡量低，因為共提物很容易對檢測結果造成干擾［6］，影響結果的準確性，同時也會縮短設備使用壽命。批量性的檢測任務也促使獸藥殘留檢測技術不斷向前處理簡單、高通量、自動化方向發(fā)展。因此，樣品制備既需要能獲得好的回收率、較少引入雜質的提取方式，減輕樣品凈化的難度，又需要該方法具備通用性、簡單易操作［7-8］。甲酸和乙腈是目前高通量檢測技術較為常用的提取溶液［9-10］。

目前關于獸藥殘留方法有效性驗證的研究較多［11-13］，專門針對提取環(huán)節(jié)考察的相對較少［14］。筆者比較了豬肉、雞蛋樣品中采用不同比例的乙腈和甲酸溶液進行提取時引入的雜質即共提物量［15］，同時考察了對磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類藥物回收率的影響，以期為實驗室在選取試驗條件時提供參考。

1材料與方法

1.1儀器超高效液相色譜儀UPLC I-Class（沃特世）；QTrap6500+四級桿-線性離子阱質譜儀（AB SCIEX）；全自動均質器（?？疲?；數(shù)顯型渦旋儀（IKA）；超聲清洗儀（科導）；超純水儀RiOsTM（密理博）；恒溫干燥箱（賽默飛）。

1.2試劑乙腈（質譜級，默克）；甲醇（質譜級，默克）；甲酸（質譜級，TCI）。標準物質混合標準溶液購自天津阿爾塔科技有限公司，含量均為100 μg/mL，包括22種磺胺類［磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺二甲異惡唑、苯?；前?、磺胺喹惡啉、磺胺醋酰、甲氧芐啶、磺胺苯吡唑、磺胺脒、磺胺二甲異嘧啶、磺胺惡唑］、7種四環(huán)素類（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、甲烯土霉素、4-差向四環(huán)素、去甲金霉素）、9種喹諾酮類（恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹）。

1.3標準溶液配制

1.3.1混合標準儲備液。分別準確移取適量標準物質混合標準溶液，用甲醇定容，配制成2 000 ng/mL混合標準儲備液，棕色儲液瓶存儲，-18 ℃保存。

1.3.2混合標準工作液。分別移取適宜量的混合標準儲備液，配制成100 ng/mL的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4試驗方法

1.4.1樣品前處理方法優(yōu)化。準確稱取試樣2 g（精確至0.01 g），置于50 mL帶蓋塑料離心管中，加混合標準工作液200 μL（即加標量10 μg/kg）。分為2組，第一組分別加入10 mL乙腈水溶液，其中乙腈含量分別為70%、80%、90%、100%。第二組分別加入10 mL 90%乙腈溶液［即乙腈∶水=9∶1（v∶v）］，其中甲酸含量分別為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%。均質器均質提取30 s，超聲提取2 min，8 000 r/min離心3 min。取2 mL提取液40 ℃以下氮吹至近干，1 mL 10%水乙腈溶液復溶，10 000 r/min離心5 min后取清液，供UPLC-MS/MS分析。每種提取方式做3個重復試驗，扣除空白后取3次加標回收結果的平均值。

1.4.2共提物測定。準確移取5 mL上述提取液至預稱重（精確至0.000 1 g）的玻璃試管中，50 ℃氮吹至干，105 ℃烘箱烘干過夜，稱重。每種提取方式做3個重復試驗，扣除空白后取3次共提物百分比結果的平均值。共提物百分比的計算公式如下：

共提物百分比=試管最終重量-試管初始重量/5 mL提取液對應樣品重量×100%

1.4.3色譜條件。色譜柱為Waters BEH C（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫45 ℃，進樣體積2 μL，流速0.30 mL/min。A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫：0 min 98%A，0.5 min 98%A，13.0 min 1%A，15.0 min 1%A，15.1 min 98%A，17.0 min 98%A。

1.4.4質譜條件。電噴霧（ESI）離子源，分段多反應監(jiān)測采集模式，掃描窗口60 s。霧化電壓（IS）5 500 V（正），氣簾氣（CUR）206.8 kPa，離子源溫度（TEM）500 ℃，霧化氣（GS1）344.7 kPa，輔助加熱氣（GS2）413.7 kPa。

2結果與分析

2.1共提物比較提取過程中難以避免地會將樣品中的蛋白質、脂肪等雜質帶入提取液，這些雜質對目標物的響應信號會產生一定的基質效應，對儀器也會造成污染。通過重量分析法測定提取液中共提物的重量，來比較不同比例的乙腈和甲酸可能帶來的雜質。

從豬肉和雞蛋樣品在70%、80%、90%、100%乙腈以及0.1%、0.2%、0.5%、1.0%甲酸含量的條件下共提物百分比的變化（圖1）可以看出，在豬肉樣品中，乙腈比例由70%升至100%，共提物百分比從4.11%降至1.94%；甲酸比例由0.1%升至1.0%，共提物百分比從2.84%升至3.44%。在雞蛋樣品中，乙腈比例由70%升至100%，共提物百分比從1.67%降至1.08%；甲酸比例由0.1%升至1.0%，共提物百分比從1.29%升至1.52%。

乙腈具有良好的沉淀蛋白質的作用。通過試驗發(fā)現(xiàn)，豬肉樣品在100%乙腈中結塊現(xiàn)象嚴重，不利于樣品在提取液中的分散。酸性條件下樣品本身的溶出物也會受到影響，在該試驗條件下，隨著酸性增強，溶出物增多，共提物增加。但酸性條件可能會促使質子化的獸藥與樣品基質的吸附作用減弱，利于藥物釋放。因此考察90%乙腈溶液條件下不同獸藥殘留物的回收率。

2.2對磺胺類獸藥回收率的影響磺胺類藥物具有較高的極性，易溶于極性有溶劑，除磺胺脒呈堿性，其他多為酸堿兩性物質，在酸性條件下更易溶于有機相中。不同含量乙腈和甲酸對豬肉中磺胺類藥物回收率的影響見表1。整體而言，除去磺胺吡啶和磺胺醋酰，80%、90%、100%乙腈和0.1%、0.2%、0.5%、1.0%甲酸（乙腈∶水=9∶1，v/v）作為提取液均能滿足回收率要求，10 μg/kg的加標量回收率均在60%～120%。相較于90%乙腈，提取液中加入一定量的甲酸，能夠顯著提高磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺惡唑的回收率。對于磺胺醋酰，回收率比較低，1.0%甲酸-90%乙腈溶液可將回收率提高至65.4%。

在雞蛋樣品中，除去磺胺吡啶和磺胺醋酰，80%、90%乙腈和0.1%、0.2%、0.5%、1.0%甲酸作為提取液均能滿足回收率要求，10 μg/kg的加標量回收率均在60%～120%?；前芳奏缍蛟?00%乙腈作為提取溶液時，回收率下降至58.5%。相較于90%乙腈，提取液中加入一定量的甲酸，能夠顯著提高磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺惡唑的回收率。結合共提物百分比，0.1%甲酸-90%乙腈水溶液或0.5%甲酸-90%乙腈水溶液較適合豬肉和雞蛋22種磺胺類藥物的提取。

2.3對四環(huán)素類獸藥回收率的影響四環(huán)素類藥物含有若干親水的羥基，易溶于水，在中性和酸性溶液中較穩(wěn)定。表2顯示了不同含量乙腈和甲酸對豬肉中四環(huán)素類藥物回收率的影響。從整體趨勢而言，隨著乙腈和甲酸含量的增加，四環(huán)素類藥物回收率逐漸降低。70%、80%乙腈時，四環(huán)素類藥物回收率明顯偏高，可能存在基質增強作用。在雞蛋樣品中，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、甲烯土霉素、4-差向四環(huán)素隨著乙腈含量的增加回收率升高，在90%乙腈溶液中，隨著甲酸含量的升高，回收率升高。相同的提取液對豬肉和雞蛋2種不同基質進行提取時，呈現(xiàn)出了2種不同的回收率趨勢。龐國芳等［3］采用pH 3.0～5.5的提取液對蜂蜜中的四環(huán)素類藥物進行回收率試驗時，發(fā)現(xiàn)在pH 3.0～5.0時四環(huán)素類藥物回收率呈先增大后降低的趨勢?？梢?，提取液酸度對四環(huán)素類藥物回收率的影響是比較復雜的。除樣品性狀對提取效率的影響，基質效應也是很大的影響因素。從試驗數(shù)據(jù)上看，90%乙腈溶液較適合豬肉和雞蛋7種四環(huán)素類藥物的提取。

2.4對喹諾酮類獸藥回收率的影響在豬肉和雞蛋樣品中，恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星回收率均在150%以上，說明存在明顯的基質增強作用，不同含量的乙腈和甲酸對萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹的回收率影響不明顯，具體見表3。龐國芳等［3］采用1%乙酸-乙腈溶液和乙腈進行鰻魚及其制品中喹諾酮類藥物的提取效率比較，發(fā)現(xiàn)這2種溶液在提取效率上無明顯差異。

3結論與討論

該研究探索了不同乙腈、甲酸含量對豬肉、雞蛋中常見的磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類獸藥回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)增加乙腈比例和降低甲酸含量可以減少共提取百分比，但100%乙腈容易造成結塊，建議采用90%乙腈溶液作為提取液。酸化的乙腈溶液利于磺胺類藥物的提取，90%乙腈利于四環(huán)素類藥物的提取，對喹諾酮類藥物回收率影響不明顯，但對部分喹諾酮類藥物具有明顯的基質增強作用。豬肉樣品中酸化乙腈降低四環(huán)素類藥物的回收率，但能提高雞蛋樣品中四環(huán)素的回收率。

不同種類的獸藥在提取時對乙腈和甲酸最適含量要求有差異，在選擇提取條件時，應根據(jù)檢測需求選擇合適的提取溶液。另外，在液質聯(lián)用技術中，回收率不僅與提取效率相關，受基質作用影響也很大，需要進一步凈化或基質配標等手段以準確定量。從儀器維護保養(yǎng)角度，需要必要的凈化措施去除提取液中的共提物。而進一步的凈化能夠消除一定的基質作用，使得最終的回收率也出現(xiàn)變化。

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