甲殼素衍生物調(diào)控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達(dá)的臨床研究

陳雷剛，周向昭，王世寧，李亞維，劉媛媛，李坤

[摘要]目的：甲殼素衍生物調(diào)控瘢痕疙瘩中腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）/磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶-B（AKT）通路表達(dá)的作用。方法：選擇2020年1月-2021年10月筆者醫(yī)院接受手術(shù)切除的76例瘢痕疙瘩患者為研究對(duì)象，根據(jù)術(shù)前是否使用甲殼素衍生物分為甲殼素組（n=41）和對(duì)照組（n=35）。手術(shù)后，收集瘢痕疙瘩組織，采用免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的陽性表達(dá)率；采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；采用western blot檢測(cè)TSG-6、p-PI3K、p-AKT、鼠雙微基因2（MDM2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、裂解型caspase-3（Cleaved caspase-3）的表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6的含量。結(jié)果：甲殼素組瘢痕疙瘩組織中PCNA陽性表達(dá)率、p-PI3K、p-AKT、MDM2、Bcl-2的表達(dá)水平、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量低于對(duì)照組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、TSG-6及Cleaved caspase-3的表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：甲殼素衍生物可調(diào)控瘢痕疙瘩中的細(xì)胞增殖及凋亡，這一作用與調(diào)控TSG-6/PI3K/AKT通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；甲殼素；TSG-6/PI3K/AKT通路；凋亡；炎癥反應(yīng)

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）04-0071-04

Clinical Study of Chitin Derivatives Regulating the Expression of TSG-6/PI3K/Akt Pathway in Keloid

CHEN Leigang1，ZHOU Xiangzhao1，WANG Shining1，LI Yawei1，LIU Yuanyuan1，LI Kun2

（1.Department of Dermatology; 2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Abstract： Objective? To study the effect of chitin derivatives in regulating tumor necrosis factor alpha stimulatedgene-6 （TSG-6）/phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）/serine protein kinase-B （AKT） pathway expression in keloid. Methods? 76 patients with keloid who underwent surgical resection in our hospital from January 2020 to October 2021 were selected as the research object and divided into chitin group （n= 41） and control group （n= 35） according to whether to use chitin derivative before operation. After operation， keloid tissues were collected. The positive expression rate of PCNA was detected by immunohistochemical method， the apoptosis rate was detected by TUNEL method， and the expression levels of TSG-6， p-PI3K， p-AKT， mouse double microgene 2 （MDM2）， B cell lymphoma-2 gene （Bcl-2） and cleaved caspase-3 were detected by Western blot， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， IL-1β， IL-6 content were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results? In chitin group， the positive expression rate of PCNA， the expression levels of p-PI3K， p-AKT， MDM2， Bcl-2 and the contents of TNF-α， IL-1β， IL-6 were lower than those in the control group （P＜0.05）， and the apoptosis rate and the expression level of TSG-6 and cleaved caspase-3 were higher than those in the control group （P＜0.05）. Conclusion? Chitin derivatives regulate cell proliferation and apoptosis in keloid， which is related to the regulation of TSG-6/PI3K/Akt pathway.

Key words： keloid; chitin; TSG-6/PI3K/Akt pathway; apoptosis; inflammatory reaction

皮膚創(chuàng)傷愈合是十分精細(xì)而復(fù)雜的修復(fù)過程，但是過度愈合會(huì)造成增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等病理性瘢痕的發(fā)生[1-2]。瘢痕疙瘩形成的病理基礎(chǔ)是結(jié)締組織過度增生與透明變性，腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）/磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶-B（AKT）通路介導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的不斷增生及凋亡在該過程中發(fā)揮重要作用[3]。瘢痕疙瘩患者會(huì)出現(xiàn)局部瘙癢、疼痛等不適癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致瘢痕性攣縮，尤其在關(guān)節(jié)處瘢痕攣縮常導(dǎo)致嚴(yán)重功能障礙，因此皮膚創(chuàng)傷愈合過程中瘢痕疙瘩的防治及相關(guān)機(jī)制的研究是重要臨床課題。甲殼素是廣泛存在于低等動(dòng)物外殼細(xì)胞壁中的一種天然生物高分子，有臨床研究報(bào)道，甲殼素衍生物對(duì)燒傷創(chuàng)面的愈合具有促進(jìn)作用[4-5]；有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲殼素衍生物對(duì)瘢痕形成具有抑制作用[6]，但目前甲殼素衍生物治療瘢痕疙瘩的作用及機(jī)制尚缺乏臨床證據(jù)。本研究將以接受手術(shù)切除治療的瘢痕疙瘩患者為對(duì)象，觀察甲殼素衍生物對(duì)瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達(dá)的調(diào)控作用，旨在為深入認(rèn)識(shí)甲殼素衍生物在瘢痕疙瘩中的防治作用提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1? 資料和方法

1.1 一般資料：選擇2020年1月-2021年10月筆者醫(yī)院接受手術(shù)切除的76例瘢痕疙瘩患者為研究對(duì)象，根據(jù)手術(shù)前是否使用甲殼素凝膠治療分為甲殼素組和對(duì)照組，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過手術(shù)對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行切除者；②術(shù)前未接受任何治療或僅接受過甲殼素凝膠涂抹者；③患者知曉并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、免疫功能紊亂、血液系統(tǒng)疾病；②合并其他皮膚疾病；③手術(shù)標(biāo)本未保留。

1.4 方法

1.4.1 兩組患者術(shù)前瘢痕疙瘩治療：甲殼素組術(shù)前將改性甲殼素創(chuàng)面修復(fù)凝露（20克/支）涂于瘢痕疙瘩組織，涂抹厚度＞1 mm，涂抹范圍超過創(chuàng)緣1 cm，每天2次，連續(xù)涂抹14 d；對(duì)照組術(shù)前不接受任何治療。

1.4.2 標(biāo)本收集及保存：收集手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織，生理鹽水清洗后分為兩份，一份放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，而后進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊室溫保存；另一份放入凍存管，在液氮中冷凍30 min，取出后放入-80℃超低溫保存箱保存。

1.4.3 免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）陽性表達(dá)率：取瘢痕疙瘩的蠟塊，制作厚度4μm的病理切片，采用SP二步法免疫組織化學(xué)試劑盒（上海邦奕生物公司）進(jìn)行檢測(cè)，孵育PCNA的一抗（1：200稀釋，SantaCruz公司），顯微鏡下觀察，PCNA的染色部位主要為細(xì)胞核，用已知陽性片作陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替PCNA一抗作陰性對(duì)照，盲法讀片并判定PCNA的陽性表達(dá)情況、計(jì)算陽性表達(dá)率。陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取瘢痕疙瘩的蠟塊，制作厚度4μm的病理切片，采用TUNEL試劑盒（上海碧云天公司）進(jìn)行檢測(cè)，分別進(jìn)行TUNEL染色和DAPI染色，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下觀察染色情況，對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞和DAPI陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：取凍存的瘢痕疙瘩組織約30 mg，加入組織裂解液（上海碧云天公司），勻漿提取組織蛋白，蛋白定量后將含有30μg蛋白的樣本用于Western blot檢測(cè)，蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉后1：1 000稀釋的TSG-6、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、Bcl-2、MDM2、Cleaved caspase-3特異性一抗4℃孵育過夜，次日孵育1：2 000稀釋的二抗1 h。最后，將硝酸纖維素膜放入凝膠成像儀（Bio-rad公司）中，化學(xué)發(fā)光得到蛋白條帶，計(jì)算TSG-6、Bcl-2、MDM2、Cleaved caspase-3灰度值與β-actin灰度值的比值及p-PI3K、p-AKT灰度值與PI3K、AKT灰度值的比值。

1.4.6 Elisa法檢測(cè)細(xì)胞因子含量：取凍存的瘢痕疙瘩組織約30 mg，加入組織裂解液（上海碧云天公司），勻漿提取組織蛋白，采用Elisa試劑盒（上海西唐公司）檢測(cè)勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度，采用BCA法試劑盒（上海碧云天公司）檢測(cè)勻漿液中蛋白濃度，計(jì)算TNF-α、IL-1β、IL-6濃度與蛋白濃度的比值，得到每毫克蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；計(jì)量資料以（x?±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 甲殼素組治療前后瘢痕疙瘩大體觀察：所有患者經(jīng)甲殼素治療后瘢痕疙瘩的形態(tài)均得到了一定程度的改善，典型病例見圖1。

2.2 兩組患者瘢痕疙瘩組織中PNCA陽性表達(dá)率及細(xì)胞凋亡率比較：甲殼素組PNCA陽性表達(dá)率低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2～3。

2.3 兩組患者瘢痕疙瘩組織中TSG-6、p-PI3K、p-AKT通路表達(dá)水平比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中TSG-6的表達(dá)水平高于對(duì)照組，p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖4。

2.4 兩組患者瘢痕疙瘩組織中凋亡基因表達(dá)水平比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中Bcl-2、MDM2的表達(dá)水平低于對(duì)照組，Cleaved caspase-3的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖5。

2.5 兩組患者瘢痕疙瘩組織中炎癥細(xì)胞因子含量比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

3? 討論

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中異常形成的病理性瘢痕，外觀為高于皮膚的暗紫色硬質(zhì)腫塊，常超出皮膚創(chuàng)傷范圍呈蟹足狀生長(zhǎng)，直接影響外觀及功能，對(duì)患者的身心健康均造成不利影響。瘢痕疙瘩的治療手段包括手術(shù)、藥物、激光、冷凍、放療等，治療后局部組織中異常增生的成纖維細(xì)胞會(huì)造成瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)，不同治療手段的療效均不盡如人意[7-8]。因此，深入探索瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的瘢痕疙瘩治療手段具有迫切的臨床需求。

甲殼素又名幾丁質(zhì)，是殼制動(dòng)物中提取得到的氨基酸多肽，其衍生物具有廣泛的生物學(xué)功能，可以與結(jié)合脂肪酸結(jié)合，參與乳化并起到降脂作用，也能與腫瘤分子結(jié)合，調(diào)控免疫應(yīng)答，并起到抗腫瘤作用[9-10]。近年來，甲殼素衍生物的外用制劑被越來越多的用于臨床治療。甲殼素凝膠、甲殼素生物修復(fù)膜等用于感染創(chuàng)面的治療，能夠起到抑菌、抗感染作用[11-12]，用于燒傷創(chuàng)面的治療，能夠改善血液循環(huán)、加速創(chuàng)面愈合[4-5]。在多項(xiàng)甲殼素用于燒傷創(chuàng)面治療的臨床研究中，使用甲殼素治療的創(chuàng)面均未出現(xiàn)瘢痕愈合[4-5]。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在皮膚缺損大鼠模型中觀察到甲殼素顯著抑制瘢痕增生[6]。以上結(jié)果提示，甲殼素可能具有抑制瘢痕增生、治療瘢痕疙瘩的價(jià)值。

目前，關(guān)于甲殼素治療瘢痕疙瘩的研究均只停留在基礎(chǔ)研究階段，尚缺乏相關(guān)的臨床研究證據(jù)。本文設(shè)計(jì)了非隨機(jī)對(duì)照臨床研究，旨在獲得甲殼素治療瘢痕疙瘩的臨床證據(jù)，這也是本研究的獨(dú)特性和創(chuàng)新性所在。成纖維細(xì)胞的過度增殖、凋亡減少是瘢痕疙瘩形成的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)[13-14]。為了探索甲殼素治療瘢痕疙瘩的價(jià)值，本研究在甲殼素治療后檢測(cè)了瘢痕疙瘩中PCNA的表達(dá)水平及凋亡水平。PCNA是細(xì)胞增殖的標(biāo)志基因，其陽性表達(dá)水平反映了局部組織中的細(xì)胞增殖水平；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率直接反映細(xì)胞凋亡水平。本研究的結(jié)果顯示：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中PCNA的陽性表達(dá)率低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，表明甲殼素對(duì)瘢痕疙瘩中的細(xì)胞增殖具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，進(jìn)而也提示甲殼素對(duì)瘢痕疙瘩具有一定的治療價(jià)值。

本研究還深入探索了甲殼素發(fā)揮上述作用的可能分子機(jī)制。TSG-6蛋白在瘢痕疙瘩形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該蛋白在正常組織和細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在炎癥、外傷等刺激下表達(dá)增加并通過下游PI3K/AKT通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的調(diào)控[15-16]。已有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中證實(shí)過表達(dá)TSG-6使PI3K/AKT通路失活、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低TSG-6使PI3K/AKT通路激活、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。本研究通過檢測(cè)瘢痕疙瘩組織中該通路的表達(dá)可知：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中TSG-6的表達(dá)水平高于對(duì)照組，p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平低于對(duì)照組，表明甲殼素調(diào)控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路，這一作用與甲殼素對(duì)瘢痕疙瘩中細(xì)胞增殖的抑制作用、細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用吻合。

TSG-6所調(diào)控的PI3K/AKT通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號(hào)通路。該通路激活后，顯著增加MDM2、Bcl-2的表達(dá)，后兩者能夠抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放、阻礙Cleaved caspase-3的生成，進(jìn)而起到抑制凋亡、促進(jìn)增殖的作用。同時(shí)，該通路還能起到抗炎作用，顯著減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的釋放。在瘢痕疙瘩形成過程中，炎癥細(xì)胞因子的大量生成已經(jīng)被證實(shí)是刺激纖維結(jié)締組織增生的重要因素[17]。為了進(jìn)一步明確甲殼素用于瘢痕增生治療時(shí)對(duì)TSG-6/PI3K/AKT通路的調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了通路下游效應(yīng)基因及分子的水平。結(jié)果顯示：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中MDM2、Bcl-2的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均降低，Cleaved caspase-3的表達(dá)增加，表達(dá)甲殼素對(duì)疤痕疙瘩中增殖及凋亡基因的表達(dá)、炎癥細(xì)胞因子的生成均具有調(diào)控作用。

綜上所述，甲殼素衍生物可調(diào)控瘢痕疙瘩中細(xì)胞增殖及凋亡，這一作用與調(diào)控TSG-6/PI3K/AKT通路有關(guān)，這為今后深入認(rèn)識(shí)甲殼素在瘢痕疙瘩中的防治作用及分子機(jī)制提供了臨床研究證據(jù)。

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[收稿日期]2022-02-25

本文引用格式：陳雷剛，周向昭，王世寧，等.甲殼素衍生物調(diào)控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達(dá)的臨床研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（4）：71-75.