活化蛋白C通過調(diào)控Nrf-2/HO-1信號(hào)通道改善大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的作用研究

王浩，楊建強(qiáng)，張彬，柯友群，湛梅圣

[摘要]目的：研究活化蛋白C（Activated protein C，APC）對(duì)大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的作用及可能機(jī)制。方法：將80只SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、藥物對(duì)照組、模型組和治療組，每組20只。觀察術(shù)后72 h內(nèi)模型大鼠皮瓣形態(tài)變化，HE染色觀察大鼠皮瓣組織病理學(xué)變化，TUNEL法染色觀察皮瓣組織細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6水平，用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸TBA比色法分別測(cè)定皮瓣組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，Westernblot法檢測(cè)皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，治療組皮瓣紅腫、壞死程度、病理損傷程度減弱；TUNEL法染色觀察，與模型組比較，治療組皮瓣組織細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.05）；ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，治療組血清中TNF-α、IL-6降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05）；Westernblot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，治療組Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白相對(duì)表達(dá)水平上升（P＜0.05）。結(jié)論：APC能改善大鼠皮瓣缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]活化蛋白C；Nrf-2/HO-1信號(hào)通道；大鼠；皮瓣缺血再灌注損傷；皮瓣組織；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）04-0066-04

Effect of Activated Protein C on the Improvement of Rat Skin Flap Ischemia-reperfusion Injury by Regulating Nrf2/HO-1 Signaling Pathway

WANG Hao，YANG Jianqiang，ZHANG Bin，KE Youqun，ZHAN Meisheng

（Department of Orthopedics，Zaoyang First People's Hospital，Zaoyang 441200，Hubei，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of activated protein C（APC） on rat skin flap ischemia reperfusion injury and its possible mechanism. Methods? Eighty male SD rats were randomly divided into 4 groups： control group， model group， treatment group and drug control group， with 20 rats in each group. The morphological changes of skin flap of model rats were observed 72 h after operation. The histopathological changes of rat skin flaps were observed by HE staining. The apoptosis of skin flap tissue was observed by TUNEL staining. The levels of TNF-α and IL-6 in serum were determined by ELISA. SOD activity and MDA content of skin flap tissue were determined by xanthine oxidase and thiobarbituric acid （TBA） colorimetry. The protein expression levels of Nrf-2， HO-1 and γ-GCS in skin flap tissues were detected by Westernblot. Results? Compared with the model group， the degree of flaps redness and swelling， necrosis and pathological injury in the treatment group decreased. TUNEL staining showed that compared with the model group， the apoptosis rate in the treatment group was decreased（P＜0.05）. Compared with the model group，TNF-α and IL-6 in the treatment group were decreased by ELISA（P＜0.05）. Compared with model group， SOD activity in treatment group was increased（P＜0.05）， while MDA content was decreased（P＜0.05）. Compared with the model group，the relative expression levels of Nrf-2， HO-1 and γ-GCS were increased in the treatment group by westernblot（P＜0.05）. Conclusion? APC can improve the rat skin flap ischemia-reperfusion injury and its mechanism may be related to the activation of Nrf-2/HO-1 signaling pathway，inhibition of oxidative stress response， reduction cell apoptosis and inflammatory response.

Key words： activated protein C; Nrf-2/HO-1 signaling pathway; rat; skin flap ischemia -reperfusion injury; flap tissue; apoptosis

皮瓣組織缺血再灌注通過影響各種炎癥細(xì)胞因子、活性氧的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡加劇其損傷，成為皮瓣移植術(shù)后壞死和慢性排異反應(yīng)增加的主要原因之一[1-2]；因此，對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷（Flap ischemia reperfusion injury，F(xiàn)IR-I）的防治措施已成為目前臨床研究的熱點(diǎn)。APC是一種血漿絲氨酸蛋白酶，具有抗炎、抗凋亡、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用[3]。最新研究表明，APC可通過抑制炎癥因子表達(dá)、減輕組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[4]。APC靶向作用中性粒細(xì)胞，減輕線粒體功能障礙[5]。據(jù)研究報(bào)道[6]，大鼠靜脈注射25μg/kg APC能提高缺血皮瓣的存活率，但其作用機(jī)制尚不明確。因此本研究通過建立大鼠背部皮瓣缺血再灌注模型，觀察APC對(duì)皮瓣損傷的治療效果，探討其可能機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：活化蛋白C購自上海春麥生物科技有限公司；SOD和MDA檢測(cè)試劑盒購自北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D公司；Nrf-2、HO-1和γ-GCS抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司；680酶標(biāo)儀購自美國伯樂；熒光顯微鏡購自德國萊卡公司；BBS-DDC超凈工作臺(tái)購自山東博科。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：80只SD雄性大鼠，8周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0035。飼養(yǎng)條件：室溫22?C±3?C，相對(duì)濕度50%±10%，晝夜時(shí)間各12 h，所有大鼠均自由攝食、飲水。將大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組、藥物對(duì)照組、模型組和治療組，每組20只。實(shí)驗(yàn)取得三亞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物3R指導(dǎo)原則。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照組：行假手術(shù)，建立背部皮瓣后，立刻縫合，不進(jìn)行處理。

1.3.2 藥物對(duì)照組：于假手術(shù)前尾靜脈內(nèi)注射25μg/kg/d APC，連續(xù)5 d，其余同對(duì)照組。

1.3.3 模型組：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，按照參考文獻(xiàn)[7]建立大鼠背部皮瓣缺血再灌注損傷模型，在大鼠背部中線位設(shè)計(jì)長(zhǎng)9 cm、寬6 cm的皮瓣，皮瓣沿設(shè)計(jì)線切開、掀起，顯微血管夾阻斷供血6 h，取出血管夾，觀察恢復(fù)到皮瓣血供后，立刻原位縫合皮瓣。

1.3.4 治療組：術(shù)前尾靜脈內(nèi)注射25μg/kg/d APC[6]，連續(xù)5 d，其余同模型組。對(duì)照組和模型組術(shù)前等體積注射0.9%生理鹽水。術(shù)后7 d處死所有大鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 觀察模型大鼠皮瓣形態(tài)變化：觀察模型組和治療組大鼠術(shù)后0、24、36、48、72 h背部皮瓣水腫、壞死等現(xiàn)象，相機(jī)拍照記錄各時(shí)間段典型皮瓣。

1.4.2 HE染色觀察大鼠皮瓣組織病理學(xué)變化：術(shù)后7 d切取皮瓣組織，經(jīng)10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片5μm，所有切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.4.3 TUNEL法染色觀察皮瓣組織細(xì)胞凋亡[8]：取石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，4%多聚甲醛室溫15 min，水洗，PBS沖洗浸泡5 min，5%羊血清工作液室溫封阻30 min，PBS沖洗，依據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.4.4 ELISA法測(cè)定血清中TNF-α、IL-6水平：依據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6的含量。

1.4.5 比色法測(cè)定SOD活性、MDA含量：取皮瓣組織，加生理鹽水，制備勻漿，4℃低溫離心，取上清液，采用SOD測(cè)試盒（WST-1法）和MDA檢測(cè)試劑盒（TBA法）檢測(cè)大鼠皮瓣組織SOD活性和MDA含量。

1.4.6 Western blot法檢測(cè)皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白表達(dá)水平：取皮瓣組織100 mg，加入RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗Nrf-2（兔多克隆，1：1 000稀釋）、HO-1（兔多克隆，1：2 000稀釋）以及γ-GCS（兔多克隆，1：2 000稀釋），4℃輕搖過夜，加二抗37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯色，采用Bio-Rad成像系統(tǒng)照相，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白IOD值/內(nèi)參IOD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 APC對(duì)大鼠皮瓣缺血再灌注損傷皮瓣形態(tài)的影響：模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，72 h內(nèi)皮瓣紅腫、壞死現(xiàn)象逐漸加重；與模型組相比，治療組大鼠于術(shù)后36 h后皮瓣損傷程度逐漸降低，呈時(shí)間依賴性。見圖1。

2.2 各組大鼠皮瓣組織病理學(xué)變化：對(duì)照組和藥物對(duì)照組大鼠皮瓣組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯改變。模型組大鼠皮瓣組織肌下區(qū)存在充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，而治療組大鼠上述病理損傷程度減少。見圖2。

2.3 APC對(duì)大鼠皮瓣組織細(xì)胞凋亡的影響：與兩對(duì)照組比較，模型組大鼠皮瓣組織細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠皮瓣組織細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05）。見圖3～4。

2.4 大鼠血清TNF-α、IL-6含量變化：與兩對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組大鼠血清TNF-α、IL-6含量降低（P＜0.05），而對(duì)照組和藥物對(duì)照組比較，TNF-α、IL-6含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

2.5 各組大鼠皮瓣組織SOD活性及MDA含量：與兩對(duì)照組比較，模型組大鼠皮瓣組織SOD活性降低（P＜0.05），MDA含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組大鼠皮瓣組織SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），而對(duì)照組和藥物對(duì)照組比較，SOD活性及MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

2.6 各組大鼠皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白表達(dá)水平：與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。與模型組比較，治療組大鼠皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白相對(duì)表達(dá)水平均上升（P＜0.05），而對(duì)照組和藥物對(duì)照組比較，兩組間各蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7～8。

3? 討論

皮瓣手術(shù)在臨床上十分常見，但術(shù)后易出現(xiàn)缺血再灌注損傷，導(dǎo)致皮瓣移植后部分或全部壞死，給患者帶來很大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9-10]。APC具有廣泛的生物學(xué)活性，可參與多種疾病的生理病理過程[11]。

本研究中大鼠皮瓣形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，術(shù)后36 h治療組大鼠皮瓣損傷程度逐漸減少，且呈時(shí)間依賴性，說明APC具有減輕組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕水腫的作用；HE染色觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠皮瓣組織肌下區(qū)存在充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，說明大鼠FIR-I建模成功，而治療組大鼠上述病理損傷程度減少，提示APC可減輕FIR-I大鼠皮瓣損傷，與以往研究結(jié)果一致[11]。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，在皮瓣缺血再灌注損傷病理生理過程中發(fā)揮重要作用，因此抑制細(xì)胞凋亡成為治療FIR-I的重要方式[12-13]。TUNEL染色觀察發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮瓣組織細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），說明FIR-I可以造成皮瓣組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的改變，引起細(xì)胞的凋亡。而治療組大鼠皮瓣組織細(xì)胞凋亡率較模型組下降（P＜0.05），提示APC可抑制細(xì)胞凋亡改善皮瓣缺血再灌注損傷。

目前研究認(rèn)為，通過使用藥物抑制氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)可有效改善皮瓣缺血再灌注損傷[14-15]。眾所周知，TNF-α和IL-6是常見的促炎因子，也是缺血再灌注損傷過程中炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。研究報(bào)道，降低TNF-α的表達(dá)可減輕缺血再灌注損傷，提高皮瓣的存活率[16]。IL-6在腦缺血再灌注損傷中含量降低，可對(duì)腦損傷起保護(hù)作用[17]。本研究中ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6升高（P＜0.05），說明大鼠皮瓣缺血再灌注會(huì)激活炎癥反應(yīng)過程、促進(jìn)炎癥因子的釋放，與報(bào)道基本一致[16]。而APC治療后大鼠血清TNF-α、IL-6含量下降，說明APC具有抗炎作用，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]。

超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手，丙二醛（MDA）是體內(nèi)自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，SOD活性及MDA含量可直接反映體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[18]。SOD活性及MDA含量檢測(cè)顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮瓣組織SOD活性降低（P＜0.05），MDA含量升高（P＜0.05），說明皮瓣缺血再灌注刺激引起有害因子與機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)（SOD）進(jìn)行消耗，當(dāng)SOD被消耗后，大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡，最終使細(xì)胞死亡。同時(shí)，與模型組比較，治療組大鼠皮瓣組織SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），提示APC可清除體內(nèi)過量的自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化水平降低，抑制MDA的生成，達(dá)到抗氧化作用，從而減輕皮瓣損傷。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路是對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的主要防御機(jī)制，其通過調(diào)控下游細(xì)胞因子如血紅素加氧酶1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、抗炎因子和抗氧化酶的表達(dá)抵抗機(jī)體損傷[19-20]。HO-1作為機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)防線，其表達(dá)增多會(huì)抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生達(dá)到抗炎作用[21]；γ-GCS是Nrf2調(diào)控氧化應(yīng)激的主要酶類靶蛋白，其活性和表達(dá)水平可直接調(diào)控機(jī)體抗氧化能力[22]。Western blot結(jié)果顯示：與模型組比較，治療組大鼠皮瓣組織中Nrf-2、HO-1、γ-GCS蛋白相對(duì)表達(dá)水平上升（P＜0.05），說明APC可促進(jìn)Nrf-2向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)和活化，啟動(dòng)其下游多種抗氧化蛋白表達(dá)（γ-GCS、SOD）和Ⅱ相解毒酶（HO-1）的合成，減輕氧化應(yīng)激引起的損傷，與本研究中SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果基本一致；由于氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，觸發(fā)細(xì)胞損傷凋亡，而在腫瘤或炎癥性疾病中ROS還可以與NRF2信號(hào)通路發(fā)生相互調(diào)控，因此后續(xù)將對(duì)兩者的關(guān)系展開進(jìn)一步探討。

綜上所述，APC可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，有效改善大鼠皮瓣缺血再灌注損傷。

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[收稿日期]2021-11-05

本文引用格式：王浩，楊建強(qiáng)，張彬，等.活化蛋白C通過調(diào)控Nrf-2/HO-1信號(hào)通道改善大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（4）：66-70.