西瓜葫蘆素E變化規(guī)律及其相關(guān)基因關(guān)聯(lián)分析

欒非時(shí) ，曹瀚瀾 ，高 鵬 ，劉 識(shí) ，劉樹(shù)森 ，劉 釗，宋正峰，劉宏宇

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.山東省壽光市三木種苗有限公司，山東 壽光 262704；4.濰坊科技學(xué)院農(nóng)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，山東 壽光 262799）

西瓜（Citrullus lanatus）作為一種重要水果型蔬菜作物，在世界園藝產(chǎn)業(yè)中占有重要地位?？辔妒怯绊懳鞴掀焚|(zhì)重要因素之一，在西瓜生長(zhǎng)過(guò)程中，高溫、干旱、蟲(chóng)害及自身遺傳因素均可使其果實(shí)變苦，這種苦味是由一種名為葫蘆素（Cucurbitacin）的四環(huán)三萜類(lèi)化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致[1]。除西瓜外，在葫蘆科甜瓜[2]、籽瓜[3]和南瓜[4]中均發(fā)現(xiàn)葫蘆素。葫蘆科植物相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素作為一種苦味源，可抵御不良環(huán)境侵害，增強(qiáng)植物抗蟲(chóng)性，也與植物響應(yīng)機(jī)械損傷有關(guān)[5]?？辔队绊懳鞴仙唐穬r(jià)值，但在醫(yī)學(xué)方面，葫蘆素E 表現(xiàn)出良好藥用潛力?，F(xiàn)代研究表明，葫蘆素E具有抗腫瘤和保肝消炎等多種生物學(xué)活性[6]。

西瓜苦味主要集中在根、莖蔓和果實(shí)中，Rehm 等對(duì)葫蘆科植物種子發(fā)芽后各部位進(jìn)行葫蘆素定性分析，發(fā)現(xiàn)西瓜幼苗中主要含有的葫蘆素為葫蘆素E[7]；Lavie等發(fā)現(xiàn)西瓜屬藥西瓜果實(shí)中葫蘆素主要為E、I、L[8]，同屬西瓜屬的籽瓜濃縮汁中含有葫蘆素E[3]，Zhou 等研究也表明，西瓜果實(shí)中主要含有的葫蘆素為葫蘆素E[9]。

在葫蘆素合成代謝途徑上較為重要的酶包括氧化角鯊烯環(huán)化酶基因、細(xì)胞色素P450 基因家族和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。目前細(xì)胞色素P450 基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因在南瓜[10]、柑橘[11]、甜瓜[12]和大豆[13]中被廣泛研究。學(xué)者在西瓜基因組中鑒定得到一個(gè)MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClMATE1，該基因與葫蘆素合成基因成簇分布，且被已發(fā)現(xiàn)的葫蘆素調(diào)控因子直接調(diào)控，其產(chǎn)生的蛋白可運(yùn)輸葫蘆素E[14]；Gurudeeban等在苦味藥西瓜（Citrullus colocynthis）材料根中發(fā)現(xiàn)葫蘆二烯醇合成酶相關(guān)合成代謝基因表達(dá)[15]，楊銘慧在西瓜屬藥西瓜葉片中克隆出與葫蘆素E生物合成相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因[16]；黃三文發(fā)現(xiàn)在西瓜1號(hào)染色體上控制葫蘆素E合成的兩個(gè)bHLH 轉(zhuǎn) 錄 因 子 基 因ClBr（Cla011510）和ClBt（Cla011508），其中ClBr 在西瓜根中表達(dá)，ClBt 在西瓜果實(shí)中表達(dá)[17]。研究葫蘆素合成和調(diào)控對(duì)提高蔬菜作物經(jīng)濟(jì)價(jià)值和深入研究葫蘆素醫(yī)用價(jià)值具有重要理論與實(shí)踐意義。

本研究通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定西瓜不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)、葉片和莖蔓中葫蘆素E含量，確定葫蘆素E積累關(guān)鍵時(shí)期。結(jié)合葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘西瓜葫蘆素E 合成代謝相關(guān)基因，利用前期構(gòu)建的西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合qPCR對(duì)葫蘆素合成代謝通路上的氧化角鯊烯環(huán)化酶（OSC）基因（Cla007080），細(xì) 胞 色 素P450 基 因（Cla007077、 Cla007078、Cla007079、Cla007082、Cla008354、Cla008355），乙酰轉(zhuǎn)移酶（ACT）基因（Cla007081）和參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt（Cla011508）分析不同時(shí)期表達(dá)量，確定影響西瓜葫蘆素E積累及代謝關(guān)鍵基因，為闡明西瓜苦味形成機(jī)理、選育果實(shí)無(wú)苦味西瓜品種及后續(xù)分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.1.1 材料來(lái)源

本試驗(yàn)選擇3個(gè)田間苦味鑒定結(jié)果不同西瓜純合品系材料：①苦味西瓜（“PI 186490”），為黏籽西瓜品系，果實(shí)圓形，果皮為深綠色，白色果肉具有極端苦味，果肉及果皮致密硬實(shí)，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究屬南部研究中心提供；②甜味西瓜（Cream of Saskatchewan，“COS”），淺黃色果肉具有甜味，外皮綠色具深綠色條紋，果實(shí)球形，果實(shí)質(zhì)地疏松；③無(wú)味西瓜（“1553”），橙色果肉，外皮淺綠色無(wú)條紋，果肉無(wú)明顯風(fēng)味，質(zhì)地較為堅(jiān)硬。為保持果實(shí)生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，所有品系材料統(tǒng)一定植于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)試驗(yàn)示范基地，將每個(gè)西瓜品種5周苗齡幼苗同時(shí)移植至塑料大棚內(nèi)。

本試驗(yàn)結(jié)合前期通過(guò)其他西瓜材料構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘葫蘆素E代謝相關(guān)關(guān)鍵基因以進(jìn)一步探究其表達(dá)水平變化規(guī)律，其他西瓜材料來(lái)源如下：①三白瓜，果實(shí)為長(zhǎng)圓形，白色果肉味甜，果肉較軟，果皮呈白色；②“W1-1”，果實(shí)圓形，果皮淺綠色覆深綠色條紋，果肉紅色味甜；③“W1-92”，果實(shí)圓形，果皮深綠色，果實(shí)質(zhì)地疏松，果肉味甜。

以上西瓜材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共分3個(gè)小區(qū)，總種植面積為90 m2。每份材料種植3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 株，株距70 cm，行距60 cm。每個(gè)小區(qū)兩側(cè)設(shè)20 cm保護(hù)行。采用常規(guī)方式進(jìn)行田間管理，整枝方式采用雙蔓整枝法，每株留1個(gè)瓜，采用統(tǒng)一栽培管理措施及水肥供給。

自授粉后第10、18、26、34、42 及50 天設(shè)置6個(gè)采樣時(shí)期分別取果肉樣品，在每個(gè)品種每個(gè)發(fā)育階段收集3個(gè)具有相似發(fā)育狀態(tài)且無(wú)機(jī)械損傷西瓜果實(shí)，用于后續(xù)試驗(yàn)使用。將收獲果實(shí)橫切，從果實(shí)橫切面中心及四周共5個(gè)部位混合采取果肉樣品，共5 g，再取果實(shí)下方功能葉2 g和果柄處莖蔓材料2 g用錫箔紙包裹立即在液氮中冷凍，儲(chǔ)存在-80 ℃下用于葫蘆素測(cè)定。在另一半果實(shí)相同位置選取相同位置及重量果肉凍干后用于總核糖核酸（RNA）測(cè)定。

1.2 葫蘆素含量測(cè)定

葫蘆素含量測(cè)定依據(jù)張雅男等方法并加以改進(jìn)[18]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜系統(tǒng)，檢測(cè)果肉樣品中葫蘆素E 含量，流動(dòng)相為水（溶劑A）和乙腈（溶劑B），乙腈-水-冰醋酸（50:50:0.01，V/V）。紫外波長(zhǎng)為234 nm。流速為0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司。研磨2 g樣品后，將其溶解于5 mL 甲醇中，超聲溶解30 min，在注入前通過(guò)0.45 μm 濾膜過(guò)濾溶液，以上所有試劑均為色譜純。采用zorbaxsb-C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×100 mm，Agilent）在高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 公司）上作色譜分析，柱溫保持在室溫。每個(gè)平行試驗(yàn)3次，每個(gè)色譜峰峰面積代表葫蘆素E相對(duì)含量，配制不同濃度梯度葫蘆素E標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的色譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品色譜峰積分面積為縱坐標(biāo)（Y），得葫蘆素E 回歸方程Y=2.47×107X-22543.52，r=0.9998，線性關(guān)系良好。將所有檢測(cè)到的葫蘆素E 峰面積代入回歸方程，計(jì)算每個(gè)樣品中葫蘆素E絕對(duì)含量。根據(jù)3次獨(dú)立生物學(xué)試驗(yàn)平均值計(jì)算樣品中葫蘆素E 含量，試驗(yàn)誤差＜10%，試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件分析顯著性，得出最終結(jié)論。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 RNA提取及cDNA合成

RNA 提取使用諾禾致源（Novogene，北京）RNA 提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)操作。提取后總RNA 用1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用Rever Tra Ace qPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，大阪，日本）合成cDNA。將制備反應(yīng)體系在37 ℃下孵育15 min，在98 ℃酶失活。反轉(zhuǎn)錄之后cDNA置于-20 ℃冰箱用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3.2 qRT-PCR表達(dá)量分析

9個(gè)與葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla011508、Cla008354、Cla008355）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物根據(jù)Grassi 等由Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)[19]，經(jīng)上海生工生物工程公司合成。引物序列、CuGenDB（Cucurbit Genomics Database：葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)）登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 qPCR 反應(yīng)所用引物序列Table 1 Primer sequence for qPCR reaction

熒光數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用Microsoft?Excel 2016 軟件，以西瓜Actin（Cla020175）為內(nèi)參，所有材料熒光定量分析以其授粉后第10天表達(dá)量作為參照，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算用2-△△CT法計(jì)算[20]，每個(gè)目的基因分別進(jìn)行3 次生物和技術(shù)重復(fù)，采用Orign 8.6 作圖，使用Graphpad prism 9 作單因素方差分析（ANOVA）以分析顯著性。

1.4 分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cucurbitgenomics.org/），搜索葫蘆科不同物種中西瓜葫蘆素E代謝合成相關(guān)基因同源基因氨基酸序列，運(yùn)用MEGA 7.0軟件，通過(guò)Maximum-Likelihood 法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜材料中葫蘆素E定量分析

本研究中所采用西瓜材料在成熟期表現(xiàn)出顯著不同的葫蘆素E含量，在3個(gè)西瓜材料不同部位（果實(shí)、葉片和莖蔓）中，僅有“PI 186490”西瓜果肉和葉片中檢測(cè)到葫蘆素E（見(jiàn)圖1），其他西瓜材料果肉、葉片和莖蔓中均未檢測(cè)到葫蘆素E。“PI 186490”在授粉后不同時(shí)期西瓜果實(shí)中葫蘆素E含量差異較大，授粉后10 d時(shí)西瓜果實(shí)中葫蘆素E含量顯著高于授粉后18 d，授粉后10～26 d西瓜果實(shí)中葫蘆素E含量急劇下降。在授粉后34～50 d，葫蘆素E含量逐漸上升，最終接近授粉后10 d時(shí)葫蘆素E含量。西瓜葉片中葫蘆素E 含量同樣具有明顯差異，授粉后10 d 時(shí)葫蘆素E 含量顯著高于授粉后18 d，自授粉后10 d至授粉后34 d達(dá)到最低值，但在授粉后42 d時(shí)葉片中葫蘆素E含量顯著升高。授粉后18 d西瓜材料果實(shí)和葉片中葫蘆素E含量變化相比于授粉后10 d均顯著下降，但授粉后26～34 d果實(shí)葫蘆素E含量顯著升高，葉片中葫蘆素E含量顯著降低，授粉后34 d可能是西瓜果實(shí)中葫蘆素E積累關(guān)鍵時(shí)期。

圖1 “PI 186490”不同部位葫蘆素E含量Fig.1 Content of cucurbitacin E in different parts of"PI 186490"

2.2 葫蘆素E代謝過(guò)程中關(guān)鍵基因表達(dá)分析

本研究在6 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（授粉后10、18、26、34、42 和50 d）對(duì)3 份苦味鑒定結(jié)果不同西瓜材料進(jìn)行取樣，選取參與葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶的9 個(gè)基因：氧化角鯊烯環(huán)化酶OSC基因（Cla007080），細(xì)胞色素P450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082、Cla008354、Cla008355），乙酰轉(zhuǎn)移酶ACT基因（Cla007081）和參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt（Cla011508）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

隨授粉后西瓜果實(shí)不斷發(fā)育（見(jiàn)圖2～3），在甜味瓜“COS”中OSC基因Cla007080 表達(dá)水平在授粉后10～18 d 顯著下調(diào)表達(dá)，在無(wú)味瓜“1553”中OSC基因在發(fā)育初期表達(dá)水平顯著高于成熟期。在苦味瓜“PI 186490”中OSC基因在授粉后34 和50 d 表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)期，授粉后34 和50 d 可能是葫蘆素E積累相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控關(guān)鍵時(shí)期。

圖2 葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因在“COS”和“1533”中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化Fig.2 Expression of cucurbitacin E anabolic enzyme related genes in"COS"and"1553"

圖3 葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因在“PI 186490”中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量和葫蘆素E含量變化對(duì)比分析Fig.3 Comparative analysis of the expression of cucurbitacin E anabolic enzyme related genes and content of cucurbitacin E at different developmental time points in"PI 186490"

在CYP450家族各基因中，Cla007077、Cla007078、Cla007079 和Cla007082 在苦味瓜“PI 186490”中表達(dá)水平趨勢(shì)與其果實(shí)中葫蘆素E積累水平趨勢(shì)呈較好相關(guān)性，在甜味瓜“COS”中該家族基因與ACT基因Cla007081表達(dá)水平趨勢(shì)相似，在發(fā)育初期表達(dá)水平高于發(fā)育后期。在苦味瓜中Cla007078表達(dá)水平趨勢(shì)與葫蘆素E 積累水平趨勢(shì)一致，且ACT基因在授粉后34 d 表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他發(fā)育時(shí)期，進(jìn)一步驗(yàn)證授粉后34 d 可能是葫蘆素E 積累關(guān)鍵時(shí)期。

在甜味瓜“COS”和無(wú)味瓜“1553”中，Cla008354和Cla008355兩個(gè)同源基因表達(dá)水平趨勢(shì)相似，在授粉后10～26 d表達(dá)水平逐漸降低，隨后直到果實(shí)成熟期間表達(dá)水平逐漸升高。但在苦味瓜“PI 186490”中Cla008355 在成熟期的表達(dá)水平顯著高于Cla008354，Cla008355的表達(dá)水平從授粉后26 d到授粉后50 d期間表達(dá)顯著上調(diào)，最終達(dá)到峰值。

在苦味瓜“PI 186490”中，參與調(diào)控西瓜葫蘆素E 合成的轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt（Cla011508）表達(dá)水平趨勢(shì)和葫蘆素E積累水平趨勢(shì)相同，區(qū)別為ClBt在授粉后10～18 d 表達(dá)水平上調(diào)。在甜味瓜“COS”中ClBt在發(fā)育初期和發(fā)育后期表達(dá)水平顯著高于發(fā)育中期，ClBt表達(dá)水平峰值在授粉后42 d 出現(xiàn)。在無(wú)味瓜“1553”中轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt、ACT基因和CYP450家族基因在不同發(fā)育時(shí)期規(guī)律不明顯。

2.3 葫蘆素E 合成代謝相關(guān)酶基因在其他西瓜果肉材料中的表達(dá)分析

隨著技術(shù)進(jìn)步，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于西瓜果肉材料基因表達(dá)調(diào)控研究中，葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因在其他西瓜果肉材料中表達(dá)水平趨勢(shì)也有助于分析目的基因，本研究結(jié)合前期通過(guò)其他西瓜材料構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘葫蘆素E代謝相關(guān)酶基因進(jìn)一步探究其表達(dá)水平變化規(guī)律。

本研究在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中抽取葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因信息[21]，分析其在“PI 186490”和“三白瓜”中表達(dá)情況，結(jié)果如圖4 所示。在苦味瓜“PI 186490”中，除Cla008355 和轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt外其他基因表達(dá)水平趨勢(shì)一致，授粉后14～35 d表達(dá)量下調(diào)，至授粉后49 d 顯著上升至峰值，上調(diào)趨勢(shì)迅速，這一結(jié)果同本研究中苦味瓜葫蘆素E含量變化趨勢(shì)一致。Cla008355 和ClBt隨果實(shí)成熟表達(dá)量逐漸上調(diào)，授粉后14～35 d表達(dá)水平上調(diào)趨勢(shì)緩慢，在發(fā)育后期即授粉后35～49 d上調(diào)迅速。所有葫蘆素E 合成代謝相關(guān)酶基因在“PI 186490”的表達(dá)水平均顯著高于非苦味的“三白瓜”。“三白瓜”中細(xì)胞色素P450 基因Cla007077、Cla007078 和Cla007079 在果實(shí)發(fā)育初期即授粉后14 d 表達(dá)水平顯著高于發(fā)育后期，其他基因則相反，發(fā)育后期基因表達(dá)水平較高，轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt在“三白瓜”中不表達(dá)。

本研究在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中重點(diǎn)查看葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因在“PI 186490”和“W1-1”中表達(dá)情況[22]，結(jié)果如圖5 所示。CYP450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082 和Cla008354）和ACT基因Cla007081在苦味瓜“PI 186490”中表達(dá)水平趨勢(shì)同本研究中苦味瓜葫蘆素E 的含量變化趨勢(shì)相同，授粉后7 d表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他發(fā)育時(shí)期，授粉后7～14 d 顯著下降，授粉后14 d 隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)水平逐漸升高，在發(fā)育后期到達(dá)峰值。9個(gè)和葫蘆素E 合成代謝相關(guān)酶基因在“PI 186490”的表達(dá)量遠(yuǎn)高于“W1-1”。在甜味瓜“W1-1”中，所有基因除Cla008355外在發(fā)育初期均顯著高于發(fā)育后期。轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt未在甜味瓜中檢測(cè)出表達(dá)。

圖5 葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因在“W1-1”與“PI 186490”中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化Fig.5 Expression changes of cucurbitacin E anabolic enzyme related genes at different developmental time points in"W1-1"and"PI 186490"

本研究利用該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重點(diǎn)分析葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因在“PI 186490”“COS”和“W1-92”中表達(dá)情況[23]，結(jié)果如圖6 所示?？辔豆稀癙I 186490”中除Cla008355 和轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt（Cla011508）外，所有葫蘆素E 合成代謝酶相關(guān)基因的表達(dá)水平趨勢(shì)均與本研究中苦味瓜葫蘆素E積累趨勢(shì)相似，發(fā)育初期基因表達(dá)水平較高，在發(fā)育中期下調(diào)，隨后在發(fā)育后期上調(diào)。ClBt的表達(dá)水平自授粉后隨著果實(shí)成熟表達(dá)量逐漸上調(diào)，在成熟期達(dá)到峰值。在甜味瓜“COS”中葫蘆素E 合成代謝酶相關(guān)基因表現(xiàn)出與本研究相同的基因表達(dá)水平趨勢(shì)，在發(fā)育初期表達(dá)水平遠(yuǎn)高于發(fā)育后期。在甜味瓜“W1-92”中，OSC基因Cla007080和 部 分CYP450 基 因（Cla007077、Cla007078、Cla007079 和Cla007082）同甜味瓜“COS”表達(dá)水平趨勢(shì)相似，其他基因則無(wú)明顯規(guī)律。轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt同樣未在兩個(gè)甜味瓜材料中檢測(cè)到表達(dá)。

圖6 葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因在“PI 186490”“COS”和“W1-92”中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量變化Fig.6 Expression changes of cucurbitacin E anabolic enzyme related genes at different developmental time points in"PI 186490""COS"and"W1-92"

2.4 葫蘆科不同物種葫蘆素E 代謝酶相關(guān)基因分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將篩選得到的葫蘆科不同物種葫蘆素E代謝酶相關(guān)基因蛋白質(zhì)，運(yùn)用MEGA 7.0 軟件，通過(guò)Maximum-Likelihood法作序列比對(duì)分析且構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。如圖7 所示，葫蘆科植物中葫蘆素E合成代謝相關(guān)基因同源基因可分為3類(lèi)。

圖7 葫蘆科不同物種中葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因氨基酸序列發(fā)育樹(shù)Fig.7 Developmental tree of cucurbitacin E anabolic enzyme related genes amino acid sequence in different species of Cucurbitaceae

在第1 類(lèi)中，西瓜OSC基因Cla007080、南瓜CmaCh17G013880和甜瓜MELO3C022374所表達(dá)蛋白質(zhì)氨基酸序列高度相似，西瓜ACT基因Cla007081、冬瓜Bhi12G002104 和南瓜CmaCh08G000350 所表達(dá)蛋白質(zhì)序列也高度相似，說(shuō)明這些基因在葫蘆科各物種間存在高度同源關(guān)系。在第2 類(lèi)中，西瓜細(xì)胞色素P450 基因（Cla007078、Cla008354、Cla008355）與甜瓜、黃瓜和冬瓜中的同源基因蛋白質(zhì)氨基酸序列高度相似，說(shuō)明其蛋白質(zhì)功能相似。在第3類(lèi)中，西瓜Cla007082與南瓜CmaCh08G000340所表達(dá)蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近。

2.5 葫蘆素E 合成代謝酶相關(guān)基因在西瓜材料中序列比對(duì)

前期本課題組已對(duì)西瓜核心種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序，為探索苦味瓜“PI 186490”和非苦味瓜“COS”中葫蘆素E 合成代謝酶相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)突變情況，本研究抽取“PI 186490”和“COS”中相關(guān)基因重測(cè)序數(shù)據(jù)并與參考基因組作比對(duì)（見(jiàn)圖8）。

圖8 葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因在西瓜材料中SNP位點(diǎn)突變情況Fig.8 Mutation of cucurbitacin E anabolic enzyme related gene at SNP site in watermelon materials

其中Cla008354 和Cla007079 未比對(duì)成功，Cla007077、Cla007078和Cla008355在西瓜材料中未發(fā)生突變，而Cla007080、Cla007081 和Cla007082存在少數(shù)雜合突變和純合突變。Cla011508在苦味瓜“PI 186490”中存在較多突變，但在“COS”中未存在突變情況。

3 討論

3.1 葫蘆素E合成代謝途徑

通過(guò)研究不同葫蘆科作物中葫蘆素合成代謝關(guān)鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)葫蘆素生物合成主要是通過(guò)甲經(jīng)戊酸（MVA）合成途徑[24]，首先MVA 經(jīng)一系列合成代謝生成角鯊烯（SQ），SQ 通過(guò)角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）生成2,3-氧化角鯊烯（OSQ）。在葫蘆素生物合成中第一個(gè)重要酶是氧化角鯊烯環(huán)化酶（OSC），其催化葫蘆素生物合成第一步，葫蘆素生物合成中2,3-氧化角鯊烯受OSC催化而形成三萜類(lèi)化合物基本骨架葫蘆二烯醇，該途徑可通過(guò)OSC 基因家族不同成員的表達(dá)用于產(chǎn)生其他三萜類(lèi)化合物[25]。在基本骨架形成以后，還需經(jīng)過(guò)羥基化、乙?；推咸烟腔炔襟E，最后葫蘆二烯醇經(jīng)由細(xì)胞色素P450 基因家族及ACT 基因等基因作用下，經(jīng)不同氧化和異構(gòu)生成結(jié)構(gòu)不同的葫蘆素[26]。

3.2 葫蘆素E變化規(guī)律

研究發(fā)現(xiàn)，西瓜中主要葫蘆素是葫蘆素E[7-9]，葫蘆素E 在西瓜植株內(nèi)積累的關(guān)鍵時(shí)期尚不明晰。本研究對(duì)3種苦味鑒定結(jié)果不同的西瓜材料測(cè)定葫蘆素E，由圖1 可知，西瓜不同部位中葫蘆素E 含量呈相似積累趨勢(shì)，在苦味西瓜“PI 186490”發(fā)育初期西瓜果實(shí)和葉片中葫蘆素E 含量較高，在發(fā)育中期驟然減少后隨發(fā)育時(shí)期逐漸增加直至峰值，授粉34 d 可能是西瓜果實(shí)中葫蘆素E 積累關(guān)鍵時(shí)期。在甜味西瓜“COS”和無(wú)味西瓜“1553”果實(shí)和葉片中未檢測(cè)到葫蘆素E，3 種西瓜材料莖蔓中不含葫蘆素E。周淵研究表明[27]，ACT 基因產(chǎn)物以葫蘆素Ⅰ作底物，乙酰輔酶A 為乙酰基供體，催化生成葫蘆素E，證明在西瓜植株內(nèi)不同發(fā)育時(shí)期可能存在多種互相轉(zhuǎn)化的葫蘆素及其糖苷，本研究在苦味西瓜發(fā)育中期葫蘆素E含量驟減可能是此原因造成的。因此推測(cè)在苦味西瓜發(fā)育中期，果實(shí)中葫蘆素E隨果實(shí)發(fā)育和相關(guān)基因催化形成葫蘆素E 糖苷、其他種類(lèi)葫蘆素或其他三萜類(lèi)化合物。另一種推測(cè)為在果實(shí)發(fā)育中期西瓜植株從根部向土壤中外排葫蘆素E以增強(qiáng)抗病性及為避免合成的葫蘆素E過(guò)度積累對(duì)植株本身產(chǎn)生毒性[14]，尚待進(jìn)一步證實(shí)。

3.3 葫蘆素E相關(guān)基因表達(dá)量分析

在葫蘆科黃瓜屬中關(guān)于葫蘆素分子標(biāo)記及精細(xì)定位的相關(guān)報(bào)道較多，研究也較為深入。研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜苦味由黃瓜中葫蘆素C引起。李宗揚(yáng)研究發(fā)現(xiàn)黃瓜果實(shí)苦味基因Bt被定位在黃瓜5號(hào)染色體上，控制植株苦味物質(zhì)合成[28]。Shang等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)由9個(gè)基因組成的葫蘆素C生物合成模塊，分析其中4種相關(guān)代謝合成酶，但葫蘆素多樣性遺傳基礎(chǔ)尚不清楚[29]。馬永碩揭示9個(gè)基因負(fù)責(zé)黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素C 生物合成代謝路徑[1]。前人研究表明，除Cla011508、Cla008355 和其同源基因Cla008354 在西瓜1號(hào)染色體上，其余CYP450基因家族、OSC 基因和ACT 基因均在6 號(hào)染色體上；成功驗(yàn)證西瓜中1個(gè)OSC基因（Cla007080）、3個(gè)細(xì)胞色素P450基因（Cla007077、Cla007079、Cla008355）和1 個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ACT基因（Cla007081）的功能，但并未研究葫蘆素E積累關(guān)鍵時(shí)期[27]。

苦味瓜“PI 186490”中葫蘆素E 合成代謝酶相關(guān)基因表達(dá)模式與其果實(shí)及葉片中葫蘆素E積累趨勢(shì)一致。ClBt 基因（Cla011508）和細(xì)胞色素P450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082）表達(dá)水平在苦味瓜果實(shí)發(fā)育初期較高，發(fā)育中期逐漸降低，然后從中期逐漸上升達(dá)到峰值。OSC（Cla007080）和ACT 基因（Cla007081）在授粉后35 d表達(dá)量高于其他時(shí)期，Cla008355 和其同源基因Cla008354（氨基酸相似度87%）隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)水平逐漸上調(diào)，葫蘆素E合成代謝酶相關(guān)基因表達(dá)在果實(shí)發(fā)育周期中存在規(guī)律。本研究篩選的基因中，Cla007078 表達(dá)水平與葫蘆素E 變化規(guī)律一致，其余基因表達(dá)水平與葫蘆素E變化規(guī)律也表現(xiàn)出一定相似性。本研究對(duì)無(wú)味瓜和甜味瓜葫蘆素E代謝關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)非苦味西瓜果實(shí)發(fā)育初期關(guān)鍵基因表達(dá)水平相對(duì)發(fā)育后期較高，明顯低于苦味瓜葫蘆素E代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平。葫蘆素E代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平趨勢(shì)與葫蘆素E積累趨勢(shì)吻合，從而驗(yàn)證研究結(jié)論。

本研究結(jié)合前期通過(guò)其他西瓜材料構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘葫蘆素E代謝相關(guān)酶基因表達(dá)水平變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)葫蘆素E合成代謝相關(guān)酶基因表達(dá)水平規(guī)律與前人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)吻合，苦味西瓜“PI 186490”基因表達(dá)水平在發(fā)育初期較高，在發(fā)育中期下調(diào)后隨發(fā)育直至果實(shí)成熟期間逐漸上調(diào)至峰值，甜味瓜在發(fā)育初期基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于發(fā)育后期。表達(dá)水平在整個(gè)發(fā)育周期中呈現(xiàn)規(guī)律性，進(jìn)一步證實(shí)本研究所篩選的該組基因可能是造成葫蘆素E含量差異的主效基因。

4 結(jié) 論

本研究中，西瓜果實(shí)中葫蘆素E積累關(guān)鍵時(shí)期為授粉后26～34 d。試驗(yàn)中所篩選的Cla007078 表達(dá)水平與葫蘆素E含量變化規(guī)律一致，ACT和OSC基因在西瓜果實(shí)中葫蘆素E積累關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量高于其他時(shí)期，故本研究初步推測(cè)Cla007078、ACT和OSC 基因?yàn)槲鞴虾J素E 合成代謝相關(guān)候選基因。細(xì)胞色素P450 酶基因家族、氧化角鯊烯環(huán)化酶基因、轉(zhuǎn)錄因子基因ClBt 和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因上調(diào)表達(dá)與西瓜果實(shí)中葫蘆素E積累相關(guān)，基因表達(dá)水平與葫蘆素E變化規(guī)律具有一定相關(guān)性。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索西瓜葫蘆素E 積累相關(guān)基因功能，葫蘆素藥用潛力開(kāi)發(fā)和西瓜果實(shí)無(wú)苦味品種選育奠定基礎(chǔ)。