血清顆粒蛋白前體在Ⅰ型自身免疫性肝炎預(yù)后評估中的價(jià)值

任薈蓉 徐婷娟 武 濤 黃 玫 楊 亮

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230001；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病研究所，安徽 合肥 230001；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230001；4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染性疾病科，安徽 合肥 230001）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一類以肝臟酶類升高、高免疫球蛋白血癥、自身抗體升高和肝臟炎癥浸潤為特征的慢性自身免疫性疾病[1]；依據(jù)自身抗體類型可分為Ⅰ型AIH和Ⅱ型AIH。Ⅰ型AIH是最常見的AIH類型，患者抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）和/或抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody，ASMA）陽性，而Ⅱ型AIH患者抗肝腎微粒體1抗體陽性[2]。AIH起病隱匿，早期癥狀無臨床特異性，但誘發(fā)的肝損傷卻很嚴(yán)重，晚期需進(jìn)行肝移植。據(jù)報(bào)道，約有5.9%的AIH患者在疾病晚期階段才得以明確診斷，早期診斷對于AIH患者的預(yù)后尤為重要[3]。然而，AIH的病因?qū)W尚不清楚，這造成了目前缺乏有效的AIH治療方案和早期診斷標(biāo)志物。既往研究證實(shí)，AIH發(fā)病與遺傳、環(huán)境和免疫反應(yīng)等因素密切相關(guān)，其中免疫平衡紊亂在AIH發(fā)病過程中扮演重要角色[4]?？棺陨砀闻K抗原的免疫反應(yīng)若得不到適當(dāng)調(diào)控會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的肝臟損傷。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）1/Th2失衡與AIH的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）及其效應(yīng)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）17/IL-10平衡紊亂參與了AIH的發(fā)生、發(fā)展[5]。顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是新近發(fā)現(xiàn)的由免疫細(xì)胞廣泛表達(dá)的新型細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PGRN可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg分化，并增強(qiáng)Treg的功能[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PGRN缺陷小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能紊亂[7]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和干燥綜合征等多種自身免疫性疾病患者PGRN水平異常[7]。但關(guān)于PGRN在AIH患者中的研究很少。為此，本研究擬探討Ⅰ型AIH PGRN水平的變化及其與肝臟損傷指標(biāo)之間的關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2021年4月中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為Ⅰ型AIH的患者39例（AIH組），其中男26例、女13例，年齡（49.71±13.21）歲；ANA和ASMA均陽性6例，ANA單陽性28例，ASMA單陽性5例。所有患者均處于疾病活動(dòng)期[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）>50 U/mL]；有25例患者在急性發(fā)作時(shí)單獨(dú)使用潑尼松龍治療，中位劑量為100 mg；其他14患者采用潑尼松龍和硫唑嘌呤聯(lián)合治療，中位劑量均為100 mg。AIH診斷參照1999年國際自身免疫性肝炎小組（the International Autoimmune Hepatitis Group，IAIHG）制定的AIH診斷和臨床評分標(biāo)準(zhǔn)[8]，排除其他自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、慢性炎癥性疾病、酒精性肝病、藥物性肝病、病毒性肝炎和遺傳代謝性肝病，排除近6個(gè)月內(nèi)接受過免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療的患者。另選取同期中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢者35名（正常對照組），其中男24名、女11名，年齡（48.93±11.47）歲，均無慢性炎癥病史。2個(gè)組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020 KY倫審第124號），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理

采集Ⅰ型AIH患者治療前、健康體檢者體檢當(dāng)日清晨的空腹靜脈血10 mL，其中2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)；另8 mL置于干燥管中，離心分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于檢測血清肝臟酶類、自身抗體和PGRN、IL-10、IL-17水平。

1.2.2 各項(xiàng)指標(biāo)的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清PGRN、IL-10和IL-17水平，試劑盒均購自美國R&D公司，檢測儀器為ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A公司）。采用BC-6900全自動(dòng)血液分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測WBC。采用ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀（德國西門子公司）及配套試劑檢測ALT、AST、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、IgG、IgM和IgA水平。采用Sprinter XL全自動(dòng)熒光免疫分析儀（德國歐蒙公司）及配套試劑檢測ANA和ASMA。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 Ⅰ型AIH患者治療前后各項(xiàng)指標(biāo)的變化

追蹤隨訪12例Ⅰ型AIH患者治療后8周各項(xiàng)指標(biāo)的變化。將血清ALT升高至參考區(qū)間上限的2倍以上（ALT>90 U/L）定義為AIH復(fù)發(fā)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評估各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價(jià)血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復(fù)發(fā)的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIH組和正常對照組一般資料比較

AIH組WBC計(jì)數(shù)、ALT、AST、GGT、ALP、TB、DBil、IgG、IgM、IgA水平和ANA、ASMA陽性率均顯著高于正常對照組（P<0.05）。見表1。

表1 AIH組和正常對照組的一般資料比較

2.2 AIH組和正常對照組血清PGRN、IL-10、IL-17水平比較

AIH組血清PGRN、IL-17水平顯著高于正常對照組（P<0.05），血清IL-10水平顯著低于正常對照組（P<0.05）。見表2。

表2 AIH組和正常對照組血清PGRN、IL-10和IL-17水平比較

2.3 Ⅰ型AIH患者PGRN與其他指標(biāo)的相關(guān)性

Ⅰ型AIH患者PGRN與IL-17、GGT、IgG和IgM均呈正相關(guān)性（r值分別為0.410、0.489、0.596、0.525，P<0.05）；與IL-10、WBC計(jì)數(shù)、ALT、AST、ALP、TB、DBil和IgA均無相關(guān)性（r值分別為-0.297、0.152、0.208、0.211、0.293、0.157、0.134、0.284，P>0.05）。

2.4 Ⅰ型AIH患者治療前后血清PGRN水平變化

隨訪的12例Ⅰ型AIH患者治療后血清PGRN、ALT、AST、GGT、ALP、IgG、IgM和IgA水平均顯著低于治療前（P<0.01），見表3、圖1。有1例患者治療后PGRN水平高于治療前，追蹤發(fā)現(xiàn)該例患者為復(fù)發(fā)患者。

圖1 Ⅰ型AIH患者治療前后血清PGRN水平的變化

表3 治療前后AIH患者常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果比較

2.5 Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平與復(fù)發(fā)的關(guān)系

39例Ⅰ型AIH患者中有8例出現(xiàn)復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)組），其中3例在免疫抑制治療停止后復(fù)發(fā)、5例在免疫抑制治療期間復(fù)發(fā)；其余31例患者未復(fù)發(fā)（未復(fù)發(fā)組）。復(fù)發(fā)組治療前血清PGRN水平顯著高于未復(fù)發(fā)組（P<0.05），見圖2。

圖2 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組血清PGRN水平的比較

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復(fù)發(fā)的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.78，最佳臨界值為80.75 pg/mL，敏感性為62.50%，特異性為83.33%。見圖3。

圖3 血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討論

PGRN最初被鑒定為促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和創(chuàng)傷愈合的生長因子，由7.5個(gè)半胱氨酸基序按P-G-F-B-A-C-D-E順序組成，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中[9]。此外，PGRN也被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，可能參與了早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、抵抗宿主感染和炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程[10-11]。PGRN還可與腫瘤壞死因子受體結(jié)合，在機(jī)體免疫平衡調(diào)控中扮演重要角色[12]。WANG等[13]的研究結(jié)果顯示，椎間盤退行性變患者PGRN水平異常升高，通過調(diào)控炎癥作用軸IL-17/IL-10發(fā)揮保護(hù)作用，其主要的生物學(xué)效應(yīng)為抑制促炎細(xì)胞因子IL-17的生成，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10的分泌。LI等[14]發(fā)現(xiàn)，柯薩奇病毒B3感染患者PGRN水平升高，抑制了Th17的分化，使IL-17分泌減少。在結(jié)腸炎模型中，PGRN可誘導(dǎo)Treg分化和IL-10分泌，發(fā)揮保護(hù)作用[15]。由此可見，PGRN可能是通過調(diào)控IL-17/IL-10平衡來參與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。

IL-17/IL-10失衡目前已被證實(shí)與AIH密切相關(guān)。LIANG等[5]的研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期AIH患者IL-17水平顯著升高，IL-10水平顯著降低，與本研究結(jié)果一致。但在AIH患者中，IL-17/IL-10失衡的調(diào)控機(jī)制是否與PGRN相關(guān)并不清楚。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平顯著高于正常對照者（P=0.000），這與在皮肌炎[16]、炎癥性腸病[17]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[18]和骨關(guān)節(jié)炎[19]中的變化一致。在這幾類疾病中，PGRN均被證實(shí)通過抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮保護(hù)作用，其高表達(dá)可能是機(jī)體的代償效應(yīng)，但這種代償效應(yīng)并不足以控制機(jī)體炎癥。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者中，雖然PGRN同樣上調(diào)，但體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型均證實(shí)PGRN可通過上調(diào)炎癥因子IL-6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬途徑誘導(dǎo)胰島素耐受，導(dǎo)致糖耐量受損[20]。TANAKA等[21]也發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PGRN水平顯著升高，且與IL-6呈正相關(guān)（rs=0.47，P<0.000 1）；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGRN可促進(jìn)IL-6的分泌，參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病機(jī)制。AIH患者中高表達(dá)的PGRN是發(fā)揮保護(hù)作用還是促進(jìn)炎癥作用，有待于進(jìn)一步在動(dòng)物模型中通過過表達(dá)和基因敲除實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)，PGRN與IL-17、GGT、IgG和IgM均呈正相關(guān)（r=0.410、0.489、0.596、0.525，P<0.05），與IL-10無相關(guān)性（r=-0.297，P>0.05），提示PGRN或可作為反映Ⅰ型AIH患者炎癥程度和肝臟損傷程度的指標(biāo)之一。

本研究結(jié)果顯示，Ⅰ型AIH復(fù)發(fā)患者血清PGRN水平顯著高于未復(fù)發(fā)患者（P<0.05）；ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清PGRN判斷Ⅰ型AIH患者復(fù)發(fā)的最佳臨界值為80.75 pg/mL，敏感性為62.50%，特異性為83.33%。與持續(xù)緩解的AIH患者相比，復(fù)發(fā)患者更易發(fā)展成肝硬化，出現(xiàn)食道靜脈曲張，并因肝功能衰竭致死[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，有1例Ⅰ型AIH患者治療后血清PGRN水平高于治療前，追蹤發(fā)現(xiàn)該例患者為復(fù)發(fā)患者；另有2例AIH患者血清PGRN水平下降不明顯，推測可能與患者對免疫治療方案敏感性較低有關(guān)。由此可見，血清PGRN水平可能有助于判斷AIH的復(fù)發(fā)情況。

值得注意的是，目前用于檢測PGRN的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒并不能區(qū)分全長PGRN和顆粒蛋白片段。與全長PGRN不同的是，顆粒蛋白片段是發(fā)揮促炎效應(yīng)的[24]。因此，在某些疾病中，PGRN可能被加工成為顆粒蛋白片段，導(dǎo)致不同疾病之間的研究結(jié)論出現(xiàn)差異。此外，PGRN在不同疾病中發(fā)揮的作用可能也有一定的差異。因此，后續(xù)我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，從mRNA和蛋白水平檢測PGRN表達(dá)的變化，并通過動(dòng)物模型探討PGRN在AIH中的可能作用機(jī)制。

綜上所述，Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平升高，且與AIH的療效和復(fù)發(fā)有關(guān)，或可作為評價(jià)肝臟炎癥反應(yīng)程度、損傷程度和疾病復(fù)發(fā)的指標(biāo)。