骨肉瘤組織長鏈非編碼RNA ZFAS1的表達及其臨床意義

張銀龍 楊 紅

（1.商丘市中醫(yī)院骨科，河南 商丘 476000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450001）

骨肉瘤作為兒童和青少年人群常見且惡性程度較高的骨原發(fā)腫瘤，早期便可出現(xiàn)局部和遠隔轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時已處于中晚期[1]。盡管現(xiàn)有的手術(shù)聯(lián)合化療的治療方法不斷改進，骨肉瘤患者生存率有所提高[2]，但高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移依然是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[3]。有研究結(jié)果顯示，發(fā)生復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者5年生存率<20%[4]。因此，深入研究和尋找與骨肉瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的機制和敏感基因，已成為骨肉瘤綜合防治的重點和難點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為長度>200 nt，且沒有蛋白編碼功能的RNA，已被證實參與了染色質(zhì)重構(gòu)、組蛋白修飾、細胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程[5]，并且可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多水平上調(diào)控基因表達，影響細胞分化、生長等過程[6]，參與了多種疾病進程，特別是在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用[7]。鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1（zine finger antisense 1，ZFAS1）作為一種lncRNA，參與了多種惡性腫瘤發(fā)生、進展過程[8]，但其在骨肉瘤中的作用相關(guān)報道較少。本研究擬探討骨肉瘤患者癌組織中ZFAS1的表達情況，及其與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性，以期為骨肉瘤的致病機制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2009年6月—2015年6月于商丘市中醫(yī)院住院接受手術(shù)治療的骨肉瘤患者101例，其中男54例、女47例，年齡（23.35±8.17）歲。組織學(xué)類型中成骨細胞型41例，成纖維細胞型29例，軟骨母細胞型14例，混合型17例；Enneking分期Ⅰ～ⅡA期40例，ⅡB～Ⅲ期61例；發(fā)生轉(zhuǎn)移48例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行放療、化療治療，術(shù)后病理檢查證實為骨肉瘤，依從性好，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他系統(tǒng)腫瘤，有認(rèn)知功能障礙和精神疾病史，繼發(fā)性骨肉瘤，以及患有其他慢性疾病。術(shù)中留取所有骨肉瘤患者的癌組織和距離腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織，快速置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。本研究通過商丘市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（SQSZYY20081218009），所有患者或監(jiān)護人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 癌組織和癌旁組織中ZFAS1相對表達量的檢測

取癌組織和癌旁組織，剪碎，研磨至粉末狀，加入細胞裂解液，采用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，采用核酸蛋白定量檢測儀（美國Eppendorf公司）測定總RNA純度，以A260nm/A280nm比值1.80～2.10為合格。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），并以其為模板，采用PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）和CFXConnect實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），反應(yīng)條件：95 ℃1 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，38個循環(huán)。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：ZFAS1上游引物為5'-CTATTGTCCTGCCCGTTAGAG-3'，下游引物為5'-GTCAGGAGATCGAAGGTTGTAG-3'，大小為96 bp；GAPDH上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物為5'-CATCACGCCACAGTTTTCC-3'，大小為163 bp。用2-ΔΔCt法計算癌組織和癌旁組織中ZFAS1相對表達量。根據(jù)癌組織中ZFAS1相對表達量的均值，將骨肉瘤患者分為低表達組和高表達組。

1.2.2 隨訪

對所有患者隨訪5年，隨訪形式包括住院期間的查房、出院后門診復(fù)查和電話隨訪等，截止時間為2020年6月30日，終點事件為死亡，記錄患者生存時間，計算5年生存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用Kaplan-Meier生存曲線分析骨肉瘤患者的生存情況，采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析骨肉瘤患者的預(yù)后影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織ZFAS1相對表達量的比較

癌組織ZFAS1相對表達量為2.74±0.23，高于癌旁組織（1.01±0.09）（t=71.876，P<0.001）。

2.2 不同臨床病理特征的骨肉瘤患者之間ZFAS1相對表達量的比較

不同年齡、性別、組織學(xué)類型、腫瘤部位、腫瘤直徑和是否病理性骨折的骨肉瘤患者ZFAS1相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），不同Enneking分期、KPS評分、分化程度和有無遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者ZFAS1相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征的骨肉瘤患者癌組織中ZFAS1相對表達量的比較

2.3 癌組織ZFAS1相對表達量與骨肉瘤患者預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)癌組織中ZFAS1相對表達量的均值將患者分為低表達組（54例）和高表達組（47例）。101例患者隨訪時間為1～60個月，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，低表達組生存時間為（46.24±2.55）個月，5年生存率為61.11%，均高于高表達組[（26.09±2.76）個月和21.28%]（Log-Rankχ2=22.059，P<0.001）。見圖1。

圖1 不同ZFAS1相對表達量骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素分析

Cox比例風(fēng)險回歸模型結(jié)果顯示，Enneking分期、分化程度、遠隔轉(zhuǎn)移和ZFAS1表達是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立危險因素[風(fēng)險比（hazard ratio，HR）值分別為2.620、0.384、2.197、1.978，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.203～5.706、0.186～0.791、1.131～4.270、1.034～3.784]。見表2。

表2 影響患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析

3 討論

骨肉瘤患者因發(fā)病早期臨床癥狀不典型且無敏感的生物學(xué)標(biāo)志物，導(dǎo)致多數(shù)患者錯失最佳治療時機，患者整體預(yù)后不佳[9]。近年來，新輔助化療藥物逐漸被應(yīng)用于臨床，在提高骨肉瘤患者生存率方面發(fā)揮了重要作用[10]，但遠隔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍給患者生存帶來嚴(yán)重威脅[11]。隨著對骨肉瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中存在lncRNA表達譜異常[12]，lncRNA參與了骨肉瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等過程[13]。lncRNA作為一類缺乏開放閱讀框架而不具備蛋白編碼功能的RNA，位于基因“暗區(qū)”，不僅參與了多種疾病的發(fā)生[14]，而且與腫瘤發(fā)生、進展及預(yù)后密切相關(guān)[15]。ZFAS1位于人染色體20q13，表達于多種組織和器官中，功能復(fù)雜，在多種惡性腫瘤組織中表達異常[16]，且參與了腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種過程[17]。本研究結(jié)果顯示，癌組織ZFAS1相對表達量高于癌旁組織（P<0.001），說明癌組織中ZFAS1呈高表達，可能參與了骨肉瘤的發(fā)生過程；Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、KPS評分<70分、低分化和發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者癌組織ZFAS1相對表達量升高，進一步說明ZFAS1可能參與了骨肉瘤的惡性進程。

LI等[18]的研究結(jié)果顯示，ZFAS1表達上調(diào)預(yù)示膽管癌患者預(yù)后不良。FENG等[19]的研究結(jié)果顯示，ZFAS1高表達提示子宮頸癌患者預(yù)后不良。還有研究結(jié)果顯示[20]，ZFAS1可作為預(yù)測甲狀腺癌患者預(yù)后的潛在的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，ZFAS1低表達組生存時間和5年生存率均高于高表達組，說明ZFAS1表達水平與骨肉瘤患者預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，Enneking分期、分化程度、遠隔轉(zhuǎn)移和ZFAS1表達是影響患者預(yù)后的獨立危險因素（HR值分別為2.620、0.384、2.197、1.978，95%CI分別為1.203～5.706、0.186～0.791、1.131～4.270、1.034～3.784），進一步說明ZFAS1表達與患者預(yù)后有關(guān)，提示ZFAS1或可作為評估骨肉瘤患者預(yù)后的潛在的生物標(biāo)志物。

綜上所述，骨肉瘤患者癌組織lncRNA ZFAS1表達上調(diào)，且與惡性進展病理指標(biāo)和患者預(yù)后相關(guān)，但其在骨肉瘤中的具體作用機制尚待進一步研究。