張銀龍 楊 紅
(1.商丘市中醫(yī)院骨科,河南 商丘 476000;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河南 鄭州 450001)
骨肉瘤作為兒童和青少年人群常見且惡性程度較高的骨原發(fā)腫瘤,早期便可出現(xiàn)局部和遠隔轉(zhuǎn)移,多數(shù)患者確診時已處于中晚期[1]。盡管現(xiàn)有的手術聯(lián)合化療的治療方法不斷改進,骨肉瘤患者生存率有所提高[2],但高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移依然是導致患者死亡的主要因素[3]。有研究結(jié)果顯示,發(fā)生復發(fā)的骨肉瘤患者5年生存率<20%[4]。因此,深入研究和尋找與骨肉瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移相關的機制和敏感基因,已成為骨肉瘤綜合防治的重點和難點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為長度>200 nt,且沒有蛋白編碼功能的RNA,已被證實參與了染色質(zhì)重構、組蛋白修飾、細胞周期調(diào)控等生物學過程[5],并且可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多水平上調(diào)控基因表達,影響細胞分化、生長等過程[6],參與了多種疾病進程,特別是在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用[7]。鋅指結(jié)構反義轉(zhuǎn)錄本1(zine finger antisense 1,ZFAS1)作為一種lncRNA,參與了多種惡性腫瘤發(fā)生、進展過程[8],但其在骨肉瘤中的作用相關報道較少。本研究擬探討骨肉瘤患者癌組織中ZFAS1的表達情況,及其與臨床病理指標和預后的相關性,以期為骨肉瘤的致病機制研究提供參考。
選取2009年6月—2015年6月于商丘市中醫(yī)院住院接受手術治療的骨肉瘤患者101例,其中男54例、女47例,年齡(23.35±8.17)歲。組織學類型中成骨細胞型41例,成纖維細胞型29例,軟骨母細胞型14例,混合型17例;Enneking分期Ⅰ~ⅡA期40例,ⅡB~Ⅲ期61例;發(fā)生轉(zhuǎn)移48例。納入標準:術前未行放療、化療治療,術后病理檢查證實為骨肉瘤,依從性好,臨床資料完整。排除標準:合并有其他系統(tǒng)腫瘤,有認知功能障礙和精神疾病史,繼發(fā)性骨肉瘤,以及患有其他慢性疾病。術中留取所有骨肉瘤患者的癌組織和距離腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織,快速置于液氮中,-80 ℃冰箱保存。本研究通過商丘市中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(SQSZYY20081218009),所有患者或監(jiān)護人均知情同意。
1.2.1 癌組織和癌旁組織中ZFAS1相對表達量的檢測
取癌組織和癌旁組織,剪碎,研磨至粉末狀,加入細胞裂解液,采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA,采用核酸蛋白定量檢測儀(美國Eppendorf公司)測定總RNA純度,以A260nm/A280nm比值1.80~2.10為合格。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA),并以其為模板,采用PCR Master Mix(日本TaKaRa公司)和CFXConnect實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR),反應條件:95 ℃1 min;95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,73 ℃ 30 s,38個循環(huán)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。引物序列:ZFAS1上游引物為5'-CTATTGTCCTGCCCGTTAGAG-3',下游引物為5'-GTCAGGAGATCGAAGGTTGTAG-3',大小為96 bp;GAPDH上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3',下游引物為5'-CATCACGCCACAGTTTTCC-3',大小為163 bp。用2-ΔΔCt法計算癌組織和癌旁組織中ZFAS1相對表達量。根據(jù)癌組織中ZFAS1相對表達量的均值,將骨肉瘤患者分為低表達組和高表達組。
1.2.2 隨訪
對所有患者隨訪5年,隨訪形式包括住院期間的查房、出院后門診復查和電話隨訪等,截止時間為2020年6月30日,終點事件為死亡,記錄患者生存時間,計算5年生存率。
采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示,2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。采用Kaplan-Meier生存曲線分析骨肉瘤患者的生存情況,采用Cox比例風險回歸模型分析骨肉瘤患者的預后影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
癌組織ZFAS1相對表達量為2.74±0.23,高于癌旁組織(1.01±0.09)(t=71.876,P<0.001)。
不同年齡、性別、組織學類型、腫瘤部位、腫瘤直徑和是否病理性骨折的骨肉瘤患者ZFAS1相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),不同Enneking分期、KPS評分、分化程度和有無遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者ZFAS1相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
表1 不同臨床病理特征的骨肉瘤患者癌組織中ZFAS1相對表達量的比較
根據(jù)癌組織中ZFAS1相對表達量的均值將患者分為低表達組(54例)和高表達組(47例)。101例患者隨訪時間為1~60個月,Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示,低表達組生存時間為(46.24±2.55)個月,5年生存率為61.11%,均高于高表達組[(26.09±2.76)個月和21.28%](Log-Rankχ2=22.059,P<0.001)。見圖1。
圖1 不同ZFAS1相對表達量骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線
Cox比例風險回歸模型結(jié)果顯示,Enneking分期、分化程度、遠隔轉(zhuǎn)移和ZFAS1表達是影響骨肉瘤患者預后的獨立危險因素[風險比(hazard ratio,HR)值分別為2.620、0.384、2.197、1.978,95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)分別為1.203~5.706、0.186~0.791、1.131~4.270、1.034~3.784]。見表2。
表2 影響患者預后的多因素Cox比例風險回歸分析
骨肉瘤患者因發(fā)病早期臨床癥狀不典型且無敏感的生物學標志物,導致多數(shù)患者錯失最佳治療時機,患者整體預后不佳[9]。近年來,新輔助化療藥物逐漸被應用于臨床,在提高骨肉瘤患者生存率方面發(fā)揮了重要作用[10],但遠隔轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍給患者生存帶來嚴重威脅[11]。隨著對骨肉瘤發(fā)病機制研究的不斷深入,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤組織中存在lncRNA表達譜異常[12],lncRNA參與了骨肉瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等過程[13]。lncRNA作為一類缺乏開放閱讀框架而不具備蛋白編碼功能的RNA,位于基因“暗區(qū)”,不僅參與了多種疾病的發(fā)生[14],而且與腫瘤發(fā)生、進展及預后密切相關[15]。ZFAS1位于人染色體20q13,表達于多種組織和器官中,功能復雜,在多種惡性腫瘤組織中表達異常[16],且參與了腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種過程[17]。本研究結(jié)果顯示,癌組織ZFAS1相對表達量高于癌旁組織(P<0.001),說明癌組織中ZFAS1呈高表達,可能參與了骨肉瘤的發(fā)生過程;Enneking分期ⅡB~Ⅲ期、KPS評分<70分、低分化和發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者癌組織ZFAS1相對表達量升高,進一步說明ZFAS1可能參與了骨肉瘤的惡性進程。
LI等[18]的研究結(jié)果顯示,ZFAS1表達上調(diào)預示膽管癌患者預后不良。FENG等[19]的研究結(jié)果顯示,ZFAS1高表達提示子宮頸癌患者預后不良。還有研究結(jié)果顯示[20],ZFAS1可作為預測甲狀腺癌患者預后的潛在的生物標志物。本研究結(jié)果顯示,ZFAS1低表達組生存時間和5年生存率均高于高表達組,說明ZFAS1表達水平與骨肉瘤患者預后有關。本研究結(jié)果還顯示,Enneking分期、分化程度、遠隔轉(zhuǎn)移和ZFAS1表達是影響患者預后的獨立危險因素(HR值分別為2.620、0.384、2.197、1.978,95%CI分別為1.203~5.706、0.186~0.791、1.131~4.270、1.034~3.784),進一步說明ZFAS1表達與患者預后有關,提示ZFAS1或可作為評估骨肉瘤患者預后的潛在的生物標志物。
綜上所述,骨肉瘤患者癌組織lncRNA ZFAS1表達上調(diào),且與惡性進展病理指標和患者預后相關,但其在骨肉瘤中的具體作用機制尚待進一步研究。