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    PLA2R1相關(guān)膜性腎病患者血漿差異表達(dá)多肽的鑒定

    2023-05-22 08:12:34王亞捷祖白玲甘辰欣武嬌祥潔杭陳明暉林芙君胡志剛盛慧明
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:血漿差異

    王亞捷 祖白玲 甘辰欣 武嬌祥 殳 潔杭 晨 陳明暉 林芙君 胡志剛 黃 飚 盛慧明

    (1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200050;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科,上海 200092;3.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院附屬無錫兒童醫(yī)院,江蘇 無錫 214023;4.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 杭州 310018)

    原發(fā)性膜性腎?。╬rimary membranous nephropathy,PMN)是一種器官特異性自身免疫性疾病,臨床表現(xiàn)為無癥狀蛋白尿和水腫,病理特征為腎小球上皮下免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫性增厚。有一項(xiàng)大型多中心回顧性研究調(diào)查了2004—2014年我國71 151例行腎穿刺的患者,結(jié)果顯示,在11年間,中國人群中膜性腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)每年增加13%[1-2]。PMN的臨床預(yù)后差異較大,在未經(jīng)治療的患者中,約有1/3病情可自行緩解,有1/3在10年內(nèi)會(huì)進(jìn)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease,ESRD)。有學(xué)者利用激光顯微解剖和質(zhì)譜技術(shù)對PMN患者的腎臟活體組織樣本進(jìn)行研究,確定了主要的PMN相關(guān)抗原為M型磷脂酶A2受體(M-type phospholipase A2 receptor,PLA2R1)、血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域7A(thrombospondin type-1 domain 7A,THSD7A)、中性肽鏈內(nèi)切酶(neutral endopeptidase,NEP)、內(nèi)皮素(exostosin,EXT)1和EXT2[3-4]。新的蛋白和潛在抗原的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了臨床對PMN的認(rèn)知和診斷、治療的發(fā)展。相對于腎臟活體組織樣本,外周血樣本具有更易獲取且無創(chuàng)的優(yōu)勢,但目前對PMN外周血中活性小分子蛋白的研究很少[5]。因此,探討外周血血漿中新的小分子蛋白及其功能對PMN的診斷和治療意義較大。PLA2R1是PMN患者最主要的內(nèi)源性抗原,有70%~80%的PMN患者體內(nèi)可檢測到PLA2R1抗體,而在其他腎小球腎炎或繼發(fā)性腎小球疾病患者體內(nèi)則檢測不到PLA2R1抗體,提示PLA2R1對PMN有高度特異性[6]。有學(xué)者建議,在有PLA2R1抗體存在的情況下,除非懷疑患有其他疾病,否則不需要進(jìn)行腎臟活體組織檢查[7]。因此,本研究采用納升級(jí)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nano-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,nano-HPLC-MS/MS)檢測PLA2R1抗體陽性的PMN患者血漿中相對分子質(zhì)量低于3 000的小分子蛋白,分析PMN患者與健康對照者之間差異表達(dá)的小分子多肽,篩選可能參與PMN發(fā)生的小分子蛋白,尋找具有生物學(xué)意義的多肽標(biāo)志物,為篩選潛在藥物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 研究對象

    選取2020年5月—2021年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院首次接受腎臟活體組織檢查并被確診為PMN的患者28例(PMN組),其中男20例、女8例,年齡37~75歲。所有患者腎小球PLA2R1抗體陽性,排除其他自身免疫性疾病、感染、惡性腫瘤和藥物所致的并發(fā)癥等患者。選取同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院健康體檢者28名(正常對照組),其中男20名、女8名,年齡31~79歲,排除腎功能異常等可能患有腎臟疾病者。2個(gè)組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021-017-01),所有研究對象均知情同意。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本采集和處理

    采集所有研究對象靜脈血2 mL,乙二胺四乙酸二鉀抗凝,離心分離血漿。

    1.2.2 血漿PLA2R1相關(guān)抗體和補(bǔ)體檢測

    采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測血漿抗PLA2R1-IgG抗體和抗PLA2R1-IgG4抗體滴度,試劑盒購自浙江博實(shí)生物科技有限公司。血漿抗 PLA2R1-IgG抗體滴度≥14.00 RU/mL、抗PLA2R1-IgG4抗體滴度≥200.00 ng/mL為陽性。采用ADVIA-2400全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑(德國西門子公司)檢測血漿C3、C4水平。

    1.2.3 多肽提取

    取500 μL血漿,與甲醇按1∶2渦旋混勻,4 ℃沉淀1 h,每10 min旋轉(zhuǎn)混勻1次。4 ℃12 000×g離心20 min,收集上清液,采用SAVANT SPD1010冷凍離心濃縮儀(美國ThermoFisher Scientific公司)冷凍抽干,用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶,經(jīng)3KD超濾管過濾后收集濾液。用去污劑去除試劑盒(美國ThermoFisher Scientific公司)去除聚乙二醇污染,經(jīng)C18固相萃取柱脫鹽后冷凍干燥。

    1.2.4 nano-HPLC-MS/MS鑒定

    將凍干的多肽樣本溶于0.1%甲酸水溶液中,采用nano-HPLC-MS/MS檢測。檢測系統(tǒng)為EASY-nano LC 1200液相色譜系統(tǒng)+Q Exactive質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司)。上樣量為10 μL,分析柱為德國Dr Maisch公司Acclaim PepMap C18柱(75 μm×25 cm),以60 min的梯度分離樣本(0~4 min以4%B相平衡;4~46 min,B相以非線性梯度升高到60%;46~50 min,B相升高到100%,維持10 min),柱流量為0.6 μL/min,柱溫為55 °C。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析

    采用PEAKS Studio 10.6軟件(加拿大Bioinformatics Solutions公司)對原始文件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用PEAKS Studio 10.6軟件中基于數(shù)據(jù)庫的搜索鑒定算法對GDP21080373數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,檢索參數(shù):碎片離子質(zhì)量容許誤差為0.02,母離子質(zhì)量容許誤差為0.007‰,可變修飾為Oxidation(M) 15.99、Acetylation(Protein N-term)42.01、Deamidation(NQ)0.98。按1%錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)過濾質(zhì)譜圖/肽段,獲得鑒定后的質(zhì)譜圖和肽段列表,然后在蛋白水平上以1%FDR和1 unique peptide再次進(jìn)行質(zhì)控過濾,最后基于特異譜峰面積強(qiáng)度進(jìn)行半定量。差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn):對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA),取|fold change|>1.2、P<0.05的差異蛋白。

    1.3 生物信息學(xué)分析

    在線獲取多肽等電點(diǎn)(isoelectric point,PI)和相對分子質(zhì)量信息(https://web.expasy.org/protparam/)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)尋找差異多肽的來源。使用Blast2GO 5軟件進(jìn)行功能注釋,采用GOATOOLS軟件對差異多肽進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集,采用David BioInformation Resources 6.8軟件(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。

    1.4 差異表達(dá)多肽的驗(yàn)證

    利用差異表達(dá)多肽標(biāo)準(zhǔn)工作液在AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS系統(tǒng)中篩選并建立定量檢測的多重反應(yīng)監(jiān)測離子對信息,調(diào)整DP和CE參數(shù)。采用不同質(zhì)量濃度的差異表達(dá)多肽標(biāo)準(zhǔn)工作液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(r2>0.99)。采用蛋白沉淀法提取多肽,將預(yù)冷的甲醇與血漿混勻,4 ℃14 000×g離心10 min,取上清,提取多肽。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)檢測處理后的樣本,色譜柱為Acclaim PepMap C18柱(德國Dr Maisch公司)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對PMN組和正常對照組外周血中目標(biāo)差異肽段的信號(hào)進(jìn)行定量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評估PMN患者血漿C4b與抗PLA2R1-IgG抗體的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PMN組和正常對照組血漿相關(guān)抗體和補(bǔ)體水平比較

    PMN組血漿抗PLA2R1-IgG抗體和抗PLA2R1-IgG4抗體陽性率為100%,正常對照組均為陰性。PMN組與正常對照組血漿C3、C4水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 PMN組和正常對照組血漿C3、C4和抗體水平比較

    2.2 PMN組和正常對照組血漿差異表達(dá)多肽分析

    采用nano-HPLC-MS/MS檢出903條多肽,有31條多肽在PMN組和正常對照組中呈差異表達(dá)(P<0.05,|fold change|>1.2),其中表達(dá)下調(diào)15條、表達(dá)上調(diào)16條。所有差異表達(dá)多肽及其前體蛋白見表2、表3。

    表2 PMN組較正常對照組表達(dá)下調(diào)的差異表達(dá)多肽

    表3 PMN組較正常對照組表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)多肽

    2.3 引導(dǎo)差異表達(dá)多肽的理化特性

    大多數(shù)多肽的相對分子質(zhì)量為500~1 500,PI為3.00~6.00或8.00~13.00。在31條差異表達(dá)多肽中,有8條來源于C4b。見圖1。

    圖1 31條差異表達(dá)多肽的理化特性

    2.4 差異表達(dá)多肽前體蛋白的生物信息學(xué)分析

    GO富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)多肽富集于囊泡、細(xì)胞外泌體、血液微粒、分泌顆粒腔、血小板α顆粒腔等區(qū)域;參與對無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞分泌、胞外分泌、對金屬離子的反應(yīng)、血小板脫顆粒、調(diào)節(jié)性胞吐作用、急性時(shí)相反應(yīng)、蛋白質(zhì)加工的調(diào)控、纖維蛋白溶解等生物過程;具有相同蛋白結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性等分子功能,在C5a過敏性毒素趨化受體結(jié)合、補(bǔ)體成分C1q結(jié)合等方面發(fā)揮作用,見圖2(a)~(c)。KEGG通路分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)多肽前體蛋白主要在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)分邪l(fā)揮作用,見圖2(d);其中,在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路富集的前體蛋白所占比例最大。

    圖2 差異表達(dá)多肽前體蛋白的GO富集和KEGG通路分析

    2.5 PMN患者血漿中C4b差異表達(dá)的驗(yàn)證

    基于C4b各分解多肽在血漿中的穩(wěn)定性和相對豐度,本研究選擇表2中QLNNRQIR進(jìn)行C4b定量驗(yàn)證。結(jié)果提示,PMN組血漿C4b水平為(13.35±0.47)ng/mL,顯著低于正常對照組[(22.36±5.72)ng/mL](P<0.001)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,PMN患者血漿C4b與抗PLA2R1-IgG抗體水平無相關(guān)性(r=0.03,P=0.877)。見圖3。

    圖3 PMN組與正常對照組血漿C4b水平的比較及其與抗PLA2R-IgG抗體的相關(guān)性

    3 討論

    本研究通過對PMN患者和正常對照者血漿多肽的篩選、差異分析和驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路的C4b可能在PMN的發(fā)病過程中有重要意義。PMN是一種以免疫復(fù)合物沉積為病理特征的腎小球疾病,有70%以上的PMN患者體內(nèi)可檢出PLA2R1抗體,主要亞類為IgG4[8]。PMN患者體內(nèi)的PLA2R1抗體與足細(xì)胞表達(dá)的PLA2R1形成免疫復(fù)合物,介導(dǎo)了足細(xì)胞的免疫病理損傷。由于抗PLA2R1-IgG4抗體的Fc結(jié)構(gòu)域上缺少半乳糖殘基,使甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)能直接結(jié)合IgG4,并激活C4,進(jìn)而激活MBL途徑,最終形成攻膜復(fù)合物,損傷腎小球基底膜,導(dǎo)致蛋白尿形成[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),C4b和MBL沉積(提示補(bǔ)體級(jí)聯(lián)凝集素通路的激活)與IgA腎病的不良預(yù)后相關(guān),但這一結(jié)果在膜性腎病中尚未得到證實(shí)。此外,C4b異常激活可能還會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病和精神分裂癥的發(fā)生和病情的加重。

    與免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體消耗性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡)不同,PMN患者血漿中總的補(bǔ)體蛋白(如C3和C4)水平通常不會(huì)降低。本研究發(fā)現(xiàn),PMN患者血漿中C4b水平顯著降低,可能與PMN患者補(bǔ)體沉積相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn),PMN患者半乳糖缺陷型IgG4水平升高,抗PLA2R1-IgG4抗體以糖基化依賴的方式直接結(jié)合MBL,誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架蛋白水解,進(jìn)而激活補(bǔ)體受體C3aR1或C5aR1和C5b-9補(bǔ)體復(fù)合體末端的組裝,導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)激活[11]。C4b由C4裂解而來,與C2裂解產(chǎn)物C2a形成C3轉(zhuǎn)化酶(即C4b2a形式),在補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑和凝集素途徑中發(fā)揮重要作用。PMN患者C4b多肽顯著下調(diào),提示C4b參與了PMN的補(bǔ)體激活,可作為補(bǔ)體藥物治療靶點(diǎn)的候選分子。有研究結(jié)果顯示,抑制補(bǔ)體激活旁路途徑(alternative pathway,AP)中C3轉(zhuǎn)化酶(即C3bBb形式)的形成在PMN中具有治療潛力,在海曼腎炎模型中,AP活性被抑制,幾乎沒有能被檢測到的C3沉積,阻止了疾病的進(jìn)展[12-13]。將C4b作為新的靶向藥物分子,通過抑制C4b參與C3轉(zhuǎn)化酶的形成,阻止經(jīng)典途徑和凝集素途徑的激活,可成為補(bǔ)體抑制藥物研發(fā)的新方向,為開發(fā)更特異和個(gè)性化的治療方案創(chuàng)造潛在的可能性。

    本研究通過非靶向質(zhì)譜方法獲得差異多肽表達(dá)譜,并通過生物信息學(xué)分析和定向質(zhì)譜方法進(jìn)行驗(yàn)證,獲得了C4b來源的多肽,或可作為潛在的診斷標(biāo)志物。但該多肽分子與抗PLA2R1抗體滴度無相關(guān)性,原因可能為:IgG4亞類抗體所形成的免疫復(fù)合物無法激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑,而以激活凝集素途徑為主;同時(shí),PMN的自身抗體亞類也經(jīng)歷了從IgG1到IgG3,再轉(zhuǎn)換為以IgG4為主的動(dòng)態(tài)過程;另外,病理學(xué)檢查結(jié)果也提示受損組織局部有IgG不同亞類共存的情況,血清抗體滴度和轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系也存在爭論[14]。由于受損組織抗體種類的復(fù)雜性和個(gè)體遺傳背景的差異,C4b、抗PLA2R1-IgG4抗體和局部微環(huán)境之間的關(guān)系受到多種因素的影響。這也提示補(bǔ)體來源的多肽或能從另一個(gè)角度反映PMN患者的疾病進(jìn)展。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PLA2R1相關(guān)PMN患者血漿有31條差異表達(dá)多肽,其中C4b水平顯著降低。C4b主要參與補(bǔ)體激活、免疫反應(yīng)和腎臟損傷。本研究結(jié)果為今后PMN血漿中小分子肽的分子診斷研究奠定了一定的基礎(chǔ),C4b等差異表達(dá)多肽或可作為PMN新的疾病預(yù)測分子和治療靶點(diǎn)。

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