全血免疫抑制劑ID-LC-MS/MS候選參考方法的建立和性能評價

楊曉東 李全樂 潘清清 周 靜 謝陽敏 鄒繼華 沈 敏 張 曼

（1.美康生物科技股份有限公司參考實驗室，浙江 寧波 315104；2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院檢驗科，北京 100038）

免疫抑制劑是預防實體器官移植術后移植的器官或組織發(fā)生排斥反應的主要藥物。環(huán)孢素A、他克莫司、西羅莫司、依維莫司是臨床實體器官移植術后最常用的免疫抑制劑[1]。這4種藥物的藥代動力學存在較大的個體內和個體間差異，治療窗口窄，因此需進行治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM），以實現(xiàn)安全、有效、合理用藥[2]。免疫抑制劑TDM常用的方法包括免疫法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法[3]。但免疫法交叉干擾大，準確度不高；液相色譜法檢測時間長，穩(wěn)定性較差[4]；液相色譜串聯(lián)質譜法具有靈敏度高、特異性好、準確度高等優(yōu)點，近年來已被廣泛用于免疫抑制劑的TDM。由于不同方法的檢測結果存在一定的差異，為了提高TDM常規(guī)檢測方法的準確度，也為了幫助體外診斷（in vitrodiagnosis，IVD）行業(yè)滿足國家監(jiān)管機構要求的溯源性，建立參考測量方法迫在眉睫[5-6]。目前，檢驗醫(yī)學溯源性聯(lián)合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的免疫抑制劑參考方法基于同位素稀釋質譜法原理，由TAIBON等[7]建立，采用固相萃取法對全血樣本進行前處理，可同時檢測全血中4種免疫抑制劑，但該方法檢測時間較長，選用固相萃取法進行樣本前處理，操作過程復雜，不可控因素較多。鑒于此，本研究擬采用蛋白沉淀法（protein precipitation，PPT）進行全血樣本前處理，建立一種基于同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜（isotope-dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的簡單、準確、穩(wěn)定的全血樣本4種免疫抑制劑測定候選參考方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU LC-30A液相色譜儀+AB SCIEX QTRAP 5500串聯(lián)質譜系統(tǒng)（美國SCIEX公司），accucore PFP 色譜柱（3.0 mm×50.0 mm，2.6 μm，美國ThermoFisher Scientific公司）。XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Heidolph Multi Reax漩渦混合器（德國Heidolph公司），ST 8R高速冷凍離心機（美國ThermoFisher Scientific公司）。Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司），Hamilton氣密性微量進樣針（瑞士Hamilton公司），容量瓶（日本ASone公司）。Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）。

有證參考物質他克莫司（貨號T-049）、西羅莫司（貨號S-015）、依維莫司（貨號E-068）和環(huán)孢素A（貨號C-093）購自美國Cerilliant公司；同位素內標西羅莫司-d3（貨號10286）、依維莫司-d4（貨號14001）購自美國IsoSciences公司，環(huán)孢素A-d4（貨號D8710）購自美國Medical Isotopes公司，他克莫司-13Cd4（貨號IR-14282）購自上海甄準生物科技有限公司；七水合硫酸鋅購自德國Sigma公司；乙酸銨、甲醇、甲酸為質譜級，均購自美國ThermoFisher Scientific公司。實驗用水采用Milli-Q超純水系統(tǒng)制備?？瞻兹獦颖緛碜越】抵驹刚?。

1.2 方法

1.2.1 標準品和內標制備

采用重量法制備他克莫司、西羅莫司和依維莫司濃度為10 μg/mL的混合標準儲備液，環(huán)孢素A濃度為40 μg/mL的標準儲備液，均用甲醇稀釋制備，-20 ℃密封避光保存。精密稱取不同質量的他克莫司、西羅莫司、依維莫司混合標準儲備液和環(huán)孢素A標準儲備液，制備5個濃度梯度的混合標準工作液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50、20、10、5、1 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500、200、100、50、10 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。他克莫司、西羅莫司和依維莫司的校準范圍為1～50 ng/mL，環(huán)孢素A的校準范圍為10～500 ng/mL。采用重量法分別制備他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4、環(huán)孢素A-d4的標準儲備液，并以此為基礎，制備混合內標工作液（他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4濃度為20 ng/mL，環(huán)孢素A-d4濃度為200 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 樣本前處理

用重量法準確稱取100 μL混合標準工作液或全血樣本（全血樣本在處理前-80 ℃冰凍至少10 min，以保證充分溶血），置于2 mL離心管中，加入100 μL混合內標工作液（重量法），然后加入300 μL甲醇與0.3 mol/L硫酸鋅的混合溶液（V∶V=1∶1），旋渦混勻10 min，20 000×g離心10 min，吸取上清液，用親水性針式過濾器（13.00 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯）過濾，取150 μL濾液，加入帶有玻璃內插管的進樣瓶中，進樣檢測。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱為accucore PFP 色譜柱；流動相A為含有2 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液，流動相B為含有2 mmol/L乙酸銨的水溶液，流速為0.45 mL/min，柱溫為60 ℃，進樣量為4 μL，梯度洗脫（0.0～1.0 min，40%B；1.0～3.5 min，0%B；3.50～3.51 min，0%～40%B；3.51～4.50 min，40%B）。

1.2.4 質譜分析條件

離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），離子化方式為正離子模式，離子化電壓為5 500 V，霧化溫度為400 ℃，碰撞氣強度為Medium，氣簾氣、霧化氣和輔助加熱氣分別為25、40、40 psi。以多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。具體參數(shù)見表1。

表1 質譜測定參數(shù)設置

1.3 ID-LC-MS/MS候選參考方法性能評估

1.3.1 選擇性和特異性

通過基質匹配雙空白樣本信號確認檢測系統(tǒng)的背景噪音，并進行連續(xù)監(jiān)測，以評估方法特異性和選擇性。選取來源于5名健康志愿者的雙空白（不含分析物和內標）全血樣本，分別進行前處理后進樣分析，獲得全血基質下的總離子流圖；分別提取每個分析物及其內標的選擇性反應檢測色譜圖，若在每個分析物預期的保留時間處無任何基質干擾信號，且背景噪音較小，可認為方法具有良好的特異性和選擇性。另外，通過監(jiān)測定性離子對與定量離子對的離子豐度比來判斷是否存在未知干擾物[8-9]。

1.3.2 基質效應

采用基質混合實驗的方法檢測相對基質效應。選取來源于5名健康志愿者的空白全血樣本，按照加標的方式分別制備5個相同濃度的含藥全血樣本，然后通過檢測5種混合基質樣本[溶液基質樣本（標準溶液）、全血基質樣本和二者體積比分別為5∶5、8∶2、2∶8的混合物]中每個分析物與對應內標的峰面積比值來計算相對基質效應。如果3種混合物的相對基質效應<20%，則視為無相對基質效應[10-12]。

1.3.3 定量限

通過向空白全血樣本中加入混合標準工作液的方式制備包括預期的定量限濃度在內的4個濃度梯度的樣本，分別計算每個濃度梯度樣本中每個分析物的理論濃度（C1），然后將不同濃度的樣本各分10份進行前處理，上機檢測，得到實際測定值（C2），將同時滿足偏移<15%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）<20%的濃度值定義為定量限[10-12]。

1.3.4 攜帶污染

在評估攜帶污染時，先重復進樣低值（L）樣本（定量限濃度樣本），然后交替進樣高值（H）樣本（最高濃度的混合標準工作液）和低值樣本，按如下順序進樣：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11，比較第1次進樣的低值樣本后面跟隨的低值樣本檢測結果均值A（即L2、L3、L6、L7、L8的檢測均值）與隨后進樣的高值樣本后面跟隨的低值樣本檢測結果均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的檢測均值）的差異。攜帶污染率=（B-A）/A×100%。若低于預定標準（20%），則認為在測定該高值及以下濃度時不存在明顯的攜帶污染[9-11]。

1.3.5 正確度

采用加標回收實驗評估候選參考方法的正確度。用重量法分別將3個濃度梯度的混合標準溶液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司低濃度均為100 ng/mL，中濃度均為500 ng/mL，高濃度均為1 000 ng/mL，環(huán)孢素A低、中、高濃度分別為1 000、5 000、10 000 ng/mL；用標準儲備液按重量法制備）和空白全血樣本按體積比1∶19制備3個濃度梯度的加標樣本（濃度1：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為5 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為50 ng/mL；濃度2：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為25 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為250 ng/mL；濃度3：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500 ng/mL），每個濃度樣本重復測定5次，用加標回收率（測得量/加入量）考察候選參考方法的正確度，分別計算每個濃度加標樣本的回收率[10-12]。

1.3.6 精密度

用加標的方式制備3個濃度梯度的質控樣本（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度分別為2.5、20、40 ng/mL；環(huán)孢素A濃度分別為25、200、400 ng/mL），每個濃度樣本重復測定5次，連續(xù)檢測3個批次，分別計算每個濃度質控樣本的批內CV和批間CV[10-12]。

1.4 不確定度評估

依據Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM），從校準品制備、樣本處理、儀器檢測、重復測量4個方面分析不確定度來源[主要為樣本測定的變異（不確定度A類評定）、有證參考物質濃度、天平校準因素（不確定度B類評定）]，計算合成不確定度，以擴展因子（k）=2計算擴展不確定度和相對擴展不確定度[10-12]。

2 結果

2.1 4種免疫抑制劑的校準曲線和線性范圍

他克莫司、西羅莫司和依維莫司在1～50 ng/mL范圍內，環(huán)孢素A在10～500 ng/mL范圍內有良好的線性（r>0.999）。見圖1。

圖1 4種免疫抑制劑的校準曲線圖

2.2 候選參考方法的選擇性和特異性

雙空白樣本選擇反應監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）色譜圖顯示，在每個分析物預期的保留時間處無任何基質干擾信號，且背景噪音非常小，證明候選參考方法具有良好的特異性和選擇性。典型的雙空白樣本SRM色譜圖見圖2，典型的樣本總離子流色譜圖見圖3。

圖2 典型的雙空白樣本SRM色譜圖

圖3 典型的樣本總離子流色譜圖

2.3 基質效應

采用基質混合實驗考察相對基質效應，他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的5份溶液基質樣本峰面積比值的均值分別為5.556、2.132、1.318、2.102，5份全血基質樣本的峰面積比值的均值分別為6.738、2.528、1.630、2.632，5份8∶2混合物樣本峰面積比值的均值分別為6.560、2.456、1.584、2.580，5份5∶5混合物樣本峰面積比值的均值分別為6.078、2.284、1.450、2.366，5份2∶8混合物樣本峰面積比值的均值分別為5.688、2.200、1.386、2.352。他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A相對基質效應范圍分別為0.08%～5.39%、0.02%～4.48%、0.99%～4.51%、0.71%～8.64%。4種免疫抑制劑不同比例混合物的相對基質效應均<10%，可視為無相對基質效應，即使存在基質效應，也會因同位素內標的存在而被校正。此外，通過監(jiān)測定性離子對與定量離子對的離子豐度比，未發(fā)現(xiàn)存在未知干擾。

2.4 定量限

他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度為0.50、0.75和1.00 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為7.50和10.00 ng/mL時，CV和偏移均滿足要求。為了保證定量限的穩(wěn)定、可靠，本研究設定他克莫司、西羅莫司、依維莫司定量限為1 ng/mL，環(huán)孢素A定量限為10 ng/mL。見表2。

表2 定量限樣本檢測結果

2.5 攜帶污染率

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的攜帶污染率分別為-1.87%、0.00%、-0.94%、1.48%，提示候選參考方法不存在明顯的攜帶污染。

2.6 正確度

加標回收實驗結果顯示，他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A 3個濃度梯度的加標樣本平均回收率為98.84%～100.99%，候選參考方法的正確度符合要求。見表3。

表3 他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A加標回收實驗結果

2.7 精密度

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A 3個濃度梯度質控樣本的批內CV和批間CV均<5%。見表4。

表4 候選參考方法檢測他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的精密度

2.8 不確定度評定

候選參考方法測定人全血樣本他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A濃度產生的不確定度較為合理。具體結果見表5。

表5 3個濃度梯度質控樣本不確定度評估結果

3 討論

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A均可與紅細胞結合，藥物在紅細胞和血漿之間的濃度比例超過30∶1，因此乙二胺四乙酸抗凝全血是最常用的樣本基質[13]，然而，全血樣本基質復雜，實現(xiàn)精準定量，就必須對整個檢測流程的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化。LC-MS/MS檢測全血樣本他克莫司、西羅莫司、依維莫司、環(huán)孢素A的過程涉及3個關鍵步驟：樣本前處理、色譜條件和質譜條件。在樣本前處理過樣本時，由于全血樣本黏度比較大，且均勻性較差，本研究將全血樣本先-80 ℃冰凍至少10 min，然后平衡至室溫，以保證充分溶血，從而將目標分析物從紅細胞中分離出來，經凍融后的樣本均勻性優(yōu)于未經凍融處理的樣本。本研究對蛋白沉淀劑中硫酸鋅的濃度和硫酸鋅與甲醇的比例進行優(yōu)化，以達到最佳的蛋白沉淀效率；最后將高速離心后的上清液進行過濾，以減少基質的影響，從而得到純凈的進樣樣本，整個處理過程簡單、省時。在色譜條件的選擇上，本研究對色譜柱、流動相、柱溫、流速、梯度洗脫程序進行了優(yōu)化，在保證分析靈敏度的同時，減小了各種內源性干擾物質對目標分析物的影響。質譜條件的優(yōu)化主要包括目標分析物母離子/子離子的選擇、電壓和碰撞能量的優(yōu)化、離子源參數(shù)優(yōu)化，使每個目標分析物都具有穩(wěn)定且最佳的響應，確保檢測性能的穩(wěn)定可靠。

本研究參照相關文獻[8-12]對建立的候選參考方法進行分析性能驗證。在建立方法時，所有的溶液配制和樣本移取均采用重量法。建立的候選參考方法檢測環(huán)孢素A的線性范圍為10～500 ng/mL，檢測他克莫司、西羅莫司和依維莫司的線性范圍為1～50 ng/mL；環(huán)孢素A的定量限為10 ng/mL，他克莫司、西羅莫司和依維莫司的定量限為1 ng/mL；定量限和線性范圍完全能夠滿足常規(guī)檢測的要求；相對基質效應≤8.64%，證實了同位素內標能夠校正基質效應的影響。本研究精密度評價結果顯示，不同濃度下的4種免疫抑制劑的批內CV和批間CV均<5%；環(huán)孢素A 3個濃度梯度的加標樣本回收率平均為98.84%～100.56%，他克莫司、西羅莫司和依維莫司平均為99.04%～100.99%，精密度和正確度完全能夠滿足參考測量程序的要求。

綜上所述，本研究建立的檢測4種免疫抑制劑（他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A）的ID-LC-MS/MS候選參考方法具有操作簡單、特異性強、準確度高、精密度好、分析時間短等優(yōu)點，可用于他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A項目的量值溯源和標準化，在臨床檢測中具有實際價值。