微量殘留病監(jiān)測(cè)在ETV6/RUNX1陰性和陽(yáng)性急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒預(yù)后中的意義

劉俊閃 郭明發(fā) 孫 佳 史利歡 劉 煒 段勇濤

（1. 鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院河南省小兒血液醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；2. 鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，河南 鄭州 450000）

急性B淋巴細(xì)胞白血?。╝cute B-lymphoblastic leukemia，B-ALL）是一種常見(jiàn)的兒童白血病，嚴(yán)重威脅患兒健康和生命[1]。目前，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）的治療方案以化療和造血干細(xì)胞移植為主，復(fù)發(fā)是治療失敗的最主要原因。微量殘留?。╩inimal residual disease，MRD）是指惡性血液系統(tǒng)疾病經(jīng)治療后雖然達(dá)到臨床緩解，但血液中仍殘存微小比例白血病細(xì)胞的狀態(tài)[2-3]，隨著治療的持續(xù)進(jìn)行，殘留的細(xì)胞可能會(huì)逐步減少，直至完全消失。MRD是疾病復(fù)發(fā)的隱患，持續(xù)監(jiān)測(cè)MRD是評(píng)估惡性血液系統(tǒng)疾病患者預(yù)后的重要措施。由于MRD呈動(dòng)態(tài)變化，不同時(shí)間點(diǎn)的MRD數(shù)值反映的預(yù)后意義不同[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同融合基因背景的ALL患兒，MRD狀態(tài)及其代表的預(yù)后意義有一定差異[6]，但相關(guān)研究報(bào)道較少，結(jié)論不明。本研究擬探討ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性和陰性的B-ALL患兒各時(shí)間點(diǎn)MRD的差異和臨床意義，以期為不同融合基因背景B-ALL患兒的預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月—2021年6月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的B-ALL患兒234例，其中ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性78例（陽(yáng)性組），陰性156例（陰性組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡<18歲；2）經(jīng)法美英分型標(biāo)準(zhǔn)和流式細(xì)胞術(shù)免疫分型確診為B淋巴細(xì)胞白血病的初診患兒；3）初診時(shí)接受46種融合基因檢測(cè)，確認(rèn)為ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性或無(wú)融合基因背景（常見(jiàn)融合基因檢測(cè)均為陰性）；4）在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院接受化療，并隨化療進(jìn)程接受MRD監(jiān)測(cè)；5）患兒隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）混合系白血病患兒；2）未完成化療或化療開(kāi)始3個(gè)月內(nèi)死亡患兒。

1.2 方法

收集所有患兒入院時(shí)的一般資料，包括年齡、性別、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)、臨床危險(xiǎn)度[7]，根據(jù)患兒的隨訪記錄統(tǒng)計(jì)其生存情況，無(wú)復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）定義為從第1次完全緩解至疾病復(fù)發(fā)的時(shí)間。記錄患兒誘導(dǎo)化療第15天、第33天和鞏固治療開(kāi)始前（第12周）的MRD檢測(cè)結(jié)果，分別記為MRD1、MRD2和MRD3。檢測(cè)方法：通過(guò)骨髓穿刺抽取患兒骨髓液2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，2 h內(nèi)送檢流式細(xì)胞術(shù)免疫分型檢測(cè)，檢測(cè)儀器為美國(guó)BD公司FACS canto型流式細(xì)胞儀。按照初診時(shí)的免疫分型結(jié)果制定個(gè)體化MRD檢測(cè)方案，檢測(cè)患兒有核細(xì)胞≥5×105個(gè)；采用CD45、CD19、CD38、CD20、CD10、CD34、CD58、CD123、CD13、CD33等抗體組合。首先根據(jù)CD45/CD19和CD19/SSC對(duì)CD19+細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，然后對(duì)CD19+細(xì)胞進(jìn)行其他抗體分析，以殘存細(xì)胞比例作為MRD值，MRD1和MRD2均以>1×10-3為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，MRD3以>1×10-4為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。典型MRD陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 典型MRD陽(yáng)性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線分析ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒生存率之間的關(guān)系。采用多因素Cox回歸分析評(píng)價(jià)B-ALL患兒預(yù)后的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性組和陰性組一般資料比較

陽(yáng)性組和陰性組年齡、性別、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)、臨床危險(xiǎn)度、3次MRD陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)性組和陰性組一般資料比較

2.2 陽(yáng)性組和陰性組患兒預(yù)后比較

234例患兒隨訪時(shí)間為4～46個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為26個(gè)月，有18例（7.69%）患兒復(fù)發(fā)，5例（2.14%）患兒死亡。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，與陰性組比較，陽(yáng)性組整體RFS較長(zhǎng)（χ2=4.745，P=0.029），即復(fù)發(fā)率更低。見(jiàn)圖2。

圖2 ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒RFS的關(guān)系

2.3 MRD對(duì)ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預(yù)后的影響

在陰性組內(nèi)，MRD1陽(yáng)性患兒平均RFS為40個(gè)月，與陰性患兒（42個(gè)月）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.772，P>0.05）。MRD2和MRD3陽(yáng)性患兒的平均RFS均為33個(gè)月，均短于MRD2和MRD3陰性患兒（均為43個(gè)月）（χ2值分別為9.747、11.697，P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 陰性組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)MRD與患兒RFS的關(guān)系

以各時(shí)間點(diǎn)MRD、患兒年齡、性別、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)和臨床危險(xiǎn)度（低危和中/高危）為自變量，采用Cox回歸分析B-ALL患兒預(yù)后的影響因素，方法為“條件（向前）”逐步回歸，結(jié)果顯示，年齡（≥10歲）、臨床危險(xiǎn)度（中/高危）和MRD3陽(yáng)性是陰性組患兒預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預(yù)后影響因素分析

2.4 MRD對(duì)ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性患兒預(yù)后的影響

在陽(yáng)性組內(nèi)，MRD1陽(yáng)性患兒平均RFS為44個(gè)月，與陰性患兒（42個(gè)月）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.128，P>0.05）。MRD2和MRD3陽(yáng)性患兒的平均RFS均為39、34個(gè)月，均短于MRD2和MRD3陰性患兒（均為45個(gè)月）（χ2值分別為1.567、4.266，P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)MRD與患兒RFS的關(guān)系

進(jìn)一步納入各時(shí)間點(diǎn)MRD和患兒一般資料進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，年齡≥10歲和初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥100×109/L是ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性患兒預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性患兒RFS影響因素分析

3 討論

隨著臨床診療技術(shù)的進(jìn)步，B-ALL患兒的整體生存率已逐步提高，但仍有20%～30%患兒化療失敗[8]。除環(huán)境因素外，遺傳因素也是患兒發(fā)病的重要原因。近年來(lái)，兒童白血病融合基因相關(guān)研究成果在臨床診斷上的應(yīng)用也逐漸普及。ETV6/RUNX1融合基因是一種常見(jiàn)的融合基因類型，由位于12號(hào)染色體上的ETV6基因與位于21號(hào)染色體上的RUNX1基因剪切重組后形成，可影響造血干細(xì)胞的復(fù)制、分化等生物學(xué)過(guò)程，參與白血病的發(fā)生和發(fā)展[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，約25%的B-ALL患兒ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性，占有融合基因背景B-ALL患兒的40%[10]。關(guān)于ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒預(yù)后的關(guān)系，相關(guān)研究報(bào)道其5年無(wú)病生存率顯著高于其他亞型[11]，但不同研究對(duì)這一結(jié)論存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為其有促癌作用，有學(xué)者認(rèn)為其可致病情進(jìn)展，也有學(xué)者認(rèn)為其與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。MONTA?O等[12]發(fā)現(xiàn)，敲除淋巴細(xì)胞ETV6/RUNX1融合基因，可以抑制淋巴細(xì)胞惡性增殖、凋亡抗性和體內(nèi)成瘤能力，提示該基因發(fā)揮促癌作用。AMPATZIDOU等[13]發(fā)現(xiàn)，ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性ALL患者中存在淋巴細(xì)胞克隆異質(zhì)性和MRD清除功能受損，最終導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后。BHOJWANI等[14]發(fā)現(xiàn)，ALL患兒ETV6/RUNX1陽(yáng)性表達(dá)與年齡<10歲、低風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)和治療第19天的MRD水平相關(guān)，ETV6/RUNX1陽(yáng)性患兒的無(wú)事件生存率明顯更高（P<0.05）。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)，ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性ALL患兒風(fēng)險(xiǎn)分層治療完全緩解率高、遠(yuǎn)期療效好。相關(guān)研究結(jié)果顯示，ETV6/RUNX1在白血病中的臨床意義與其作用機(jī)制有關(guān)，一方面，ETV6/RUNX1可以激活PI3K/Akt/mTOR等致癌通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和DNA損傷反應(yīng)；另一方面，ETV6/RUNX1高表達(dá)也會(huì)提高治療反應(yīng)性，利于疾病預(yù)后，爭(zhēng)議可能與研究對(duì)象和目的的差異有關(guān)[12，16]。本研究結(jié)果顯示，與陰性組比較，陽(yáng)性組患兒的RFS顯著延長(zhǎng)（P=0.029），提示ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性是患兒無(wú)復(fù)發(fā)生存的保護(hù)因素，與WANG等[15]的研究結(jié)論一致。

復(fù)發(fā)是威脅B-ALL患兒生存的最主要原因，及早診斷和調(diào)整治療方案是改善患兒預(yù)后的關(guān)鍵。隨著流式細(xì)胞術(shù)診療技術(shù)水平的逐步提高，MRD檢測(cè)也在白血病患兒化療療效監(jiān)測(cè)中廣泛開(kāi)展。盡管MRD是觀察療效最直觀的指標(biāo)，但目前關(guān)于MRD監(jiān)測(cè)的時(shí)間點(diǎn)和閾值設(shè)定仍未達(dá)成共識(shí)[17-18]。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞是在治療過(guò)程中被逐步消滅的，MRD陽(yáng)性，尤其是化療早期陽(yáng)性并不意味著患兒一定會(huì)復(fù)發(fā)；同時(shí)，因MRD閾值和檢測(cè)精度的原因，MRD陰性也不等同于癌細(xì)胞的絕對(duì)清除。目前的研究多以患兒誘導(dǎo)化療第15天、第28～33天和鞏固治療開(kāi)始前（第12～13周）為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，即多數(shù)研究認(rèn)為這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MRD與預(yù)后相關(guān)性較好[19]。目前，關(guān)于MRD與ETV6/RUNX1融合基因相關(guān)性的研究尚不多見(jiàn)，不同融合基因背景患兒MRD檢測(cè)的臨床意義是否存在差異尚無(wú)明確結(jié)論[20-21]。危彤等[6]發(fā)現(xiàn)，MRD監(jiān)測(cè)僅對(duì)無(wú)融合基因背景的B-ALL患兒的預(yù)后有意義，而對(duì)于ETV6-RUNX1或E2A-PBX1陽(yáng)性的患兒無(wú)顯著預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，陰性組中，治療第15天MRD陰性和陽(yáng)性患兒RFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而治療第33天和第12周時(shí)MRD陽(yáng)性患兒RFS顯著短于陰性患兒（P<0.05），MRD3陽(yáng)性是此類患兒預(yù)后的獨(dú)立影響因素；而陽(yáng)性組中，治療第15天和第33天MRD陰性、陽(yáng)性患兒RFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），治療第12周時(shí)MRD陽(yáng)性患兒RFS顯著短于陰性患兒（P<0.05），但多因素分析結(jié)果顯示，MRD3并非此類患兒預(yù)后的獨(dú)立影響因素。由此可以看出，不同融合基因背景下各時(shí)點(diǎn)MRD意義存在差異。分析其原因，可能在于白血病是一種遺傳因素占主導(dǎo)地位的惡性疾病，在存在融合基因的情況下，患兒病情的進(jìn)展主要受遺傳特征、基因?qū)虻纫蛩赜绊懀琈RD的預(yù)后提示價(jià)值相對(duì)較弱；在無(wú)融合基因背景的情況下，患兒的治療反應(yīng)性是決定預(yù)后的根本因素，而MRD是直接反映治療反應(yīng)的指標(biāo)，因此對(duì)預(yù)后的提示意義相對(duì)較大。臨床在制定患兒化療和療效監(jiān)測(cè)方案時(shí)，可綜合考慮患兒的融合基因背景，以合理決策，使患兒受益。

綜上所述，ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性的B-ALL患兒整體預(yù)后優(yōu)于該融合基因陰性的患兒，其中誘導(dǎo)化療第12周時(shí)的MRD水平是ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預(yù)后的獨(dú)立影響因素，但各時(shí)間點(diǎn)MRD對(duì)于ETV6/RUNX1融合基因陽(yáng)性患兒預(yù)后無(wú)顯著影響，臨床可參考患兒融合基因背景制定個(gè)性化MRD監(jiān)測(cè)方案，從而在保證預(yù)后的前提下，減少患兒穿刺操作，改善患兒診療體驗(yàn)，降低醫(yī)療成本。