黃精雙向液體發(fā)酵的菌種優(yōu)選及培養(yǎng)基優(yōu)化研究

馬緒民，孫加龍，韓春超，顧正位

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2.泰安市東麒健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 泰安 271000）

黃精（Polygonati Rhizoma）藥材來(lái)源于百合科黃精屬植物黃精，是傳統(tǒng)的藥食同源中藥，具有很好的藥用和食用價(jià)值［1-2］。 雞腿菇［Coprinus comatus（Muell.ex Fr.） Gray］，學(xué)名毛頭鬼傘，是16 種珍稀食用菌之一［3］。 蛹蟲(chóng)草［Cordyceps militaris （L.） Link］，又稱(chēng)北蟲(chóng)草，為藥食兩用真菌，含有豐富的藥理活性物質(zhì)，現(xiàn)代研究多集中于其保健和藥用方面［4-5］。秀珍菇［Pleurotus pulmonarius （Fr.） Quél］學(xué)名肺形側(cè)耳，又名小平菇，屬于食用真菌，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［6-7］。

近年來(lái)，中藥雙向液體發(fā)酵技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。 中藥液體發(fā)酵是將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在液體中制備培養(yǎng)基，隨后在其中接入菌種進(jìn)行培養(yǎng)得到目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵技術(shù)［8］。 雙向發(fā)酵是以中藥材為基質(zhì)，以藥用或食用真菌作為發(fā)酵菌種，其中中藥材為真菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)中藥材因真菌的分解作用而產(chǎn)生新的成分［9］。 本研究將二者結(jié)合，以雞腿菇、蛹蟲(chóng)草、秀珍菇為發(fā)酵菌種，對(duì)黃精進(jìn)行雙向液體發(fā)酵，通過(guò)考察菌絲體得率、抗氧化活性而優(yōu)選出發(fā)酵黃精的最優(yōu)菌種，并且對(duì)優(yōu)選出的菌種液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為黃精深層次的開(kāi)發(fā)以及增加雞腿菇發(fā)酵產(chǎn)物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

雞腿菇菌種R2000，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；蛹蟲(chóng)草菌種CICC14013，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；秀珍菇菌種LD1，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海麥克林生物科技有限公司，CAS＃1898-66-4）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、羥自由基測(cè)定試劑盒（南京建成 生 物 工 程 研 究 所，A105/A018）；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無(wú)水乙醇、葡萄糖、果糖、麥芽糖（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白胨（北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司）；蔗糖、乳糖、KH2PO4、MgSO4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

雞腿菇斜面培養(yǎng)基：20%土豆，2%葡萄糖，0.1%KH2PO4，0.1% MgSO4，2.5%瓊脂。 種子液培養(yǎng)基：20%土豆，2%麩皮，2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，0.1% MgSO4。發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽：2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，1% MgSO4。

蛹蟲(chóng)草斜面培養(yǎng)基同雞腿菇菌種。 種子液培養(yǎng)基：2%葡 萄 糖，1%蛋 白 胨，0.05% KH2PO4，0.05%MgSO4。 發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽：2%葡萄糖，2%蛋白胨，0.05% KH2PO4，0.05% MgSO4。

秀珍菇菌種培養(yǎng)基同雞腿菇菌種。 種子液培養(yǎng)基：20%土豆，2%麩皮，0.5%蛋白胨，0.2% KH2PO4，0.049% MgSO4。 發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽：2.5%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.102% KH2PO4，0.039% MgSO4。

1.3 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺(tái)：SW-CJ-1D，上海蘇靜實(shí)業(yè)有限公司；高壓滅菌鍋：YX-280D，寧波久興醫(yī)療器械有限公司；分光光度計(jì)：UV-6100S，上海美譜達(dá)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：101，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；電子天平：FA2004N，上海菁海儀器有限公司；恒溫振蕩：TS-2012C，上海印溪儀器儀表有限公司。

2 研究方法

2.1 菌種的發(fā)酵

從雞腿菇斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取5 次。接種于種子培養(yǎng)基。26 ℃，160 r/min振搖4 d［10］。

從蛹蟲(chóng)草斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取3 次，接種于種子培養(yǎng)基，26 ℃，160 r/min振搖6 d，制備蛹蟲(chóng)草種子液［11］。

從秀珍菇斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取3 次，接種于種子培養(yǎng)基，26 ℃，160 r/min振搖11 d［12］。

3 種不同的真菌進(jìn)行黃精雙向液體發(fā)酵，用500 mL 的錐形瓶，加入相應(yīng)菌種發(fā)酵培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，裝樣量300 mL，黃精濃度7.5 mg/mL，接種量10%，溫度26 ℃。 雞腿菇160 r/min 振搖5 d，蛹蟲(chóng)草靜置7 d，秀珍菇140 r/min 振搖7 d。 平行3次，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱(chēng)量。

2.2 菌種的優(yōu)選

將3 種菌絲體煎煮3 次，每次2 h，與發(fā)酵液混合，濃縮至20 mg/mL，作為最終的發(fā)酵產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?干燥的黃精（40～60 目）與蒸餾水以1∶10 的比例煎煮3 次，每次3 h，濃縮至20 mg/mL 備用。

2.2.1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)［13］

按照表1 的操作步驟加入蒸餾水，無(wú)水乙醇，樣品和DPPH 混合均勻之后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm測(cè)吸光度（OD）值，按照下列公式計(jì)算清除率。

表1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)操作步驟

表2 黃精發(fā)酵后抗氧化活性（s）

表2 黃精發(fā)酵后抗氧化活性（s）

注：DPPH 為1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼。 與黃精水提液比較，＊P＜0.01。

組別 個(gè)數(shù)黃精水提液 3黃精雞腿菇發(fā)酵 3黃精蛹蟲(chóng)草發(fā)酵 3黃精秀珍菇發(fā)酵 3 DPPH 自由基清除率/% 羥自由基抑制力/（U/mL） 總抗氧化能力/（U/mL）39.96±2.98 69.88±9.54 1.04±0.20 89.17±2.04＊ 78.12±9.02 9.37±1.56＊83.40±3.21＊ 29.84±3.13 2.15±0.64 92.15±0.76＊ 65.79±9.44 1.80±0.31

注：OD0 為空白參比吸光度值；OD1 為樣品與DPPH 自由基反應(yīng)后的吸光度值；OD2 為樣品本身吸光度值。

2.2.2 羥自由基抑制能力測(cè)定［14］

按照羥自由基測(cè)定試劑盒（A018）說(shuō)明書(shū)，用維生素C（VC）在相同濃度下對(duì)比。 取0.2 mL 樣品，于550 nm處，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定OD 值，按照公式計(jì)算。

2.2.3 總抗氧化能力測(cè)定［15］

按照T-AOC 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，用VC 在相同濃度下對(duì)比，取0.2 mL 樣品，于520 nm 處，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定OD 值。 按照下列公式計(jì)算。

2.3 黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 黃精液體發(fā)酵質(zhì)量濃度的考察

在基本營(yíng)養(yǎng)成分不變的前提下，考察黃精質(zhì)量濃度為0 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL 的液體發(fā)酵情況，每個(gè)濃度平行3 次，以生物量（g/L）為指標(biāo)，優(yōu)選黃精最佳的液體發(fā)酵濃度［16］。采用500 mL 的錐形瓶，裝樣量300 mL，140 r/min 振搖3 d，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱(chēng)量。

2.3.2 碳源種類(lèi)和含量的考察

參考張疏雨等［17］的方法，并做適當(dāng)修改。 首先以相同濃度的2%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和乳糖，每種碳源平行3 次，優(yōu)選出碳源后再進(jìn)行濃度的優(yōu)化。 設(shè)置5 個(gè)濃度：0%、2%、4%、6%、8%。 用100 mL的錐形瓶，裝樣量50 mL，140 r/min 振搖3 d，將菌絲體進(jìn)行抽濾，40 ℃烘干，稱(chēng)量。

2.3.3 氮源種類(lèi)和含量的考察

參考孟麗君等［18］的方法，并做適當(dāng)修改。 首先以相同濃度的5%的麩皮、蛋白胨、酵母膏、酪蛋白胨和硫酸銨作為氮源，優(yōu)選出氮源后再進(jìn)行濃度的優(yōu)化。設(shè)置5 個(gè)濃度：0%、2.5%、5%、7.5%、10%。 采用100 mL的錐形瓶，裝樣量50 mL，發(fā)酵3 d，平行3 次，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱(chēng)量。

2.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以合適的碳源、氮源以及黃精濃度作為試驗(yàn)的三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)三個(gè)水平，另外設(shè)置空白因素和空白水平項(xiàng)，設(shè)計(jì)L9（34）因素水平表，按照該表進(jìn)行試驗(yàn)，平行3 次，取平均值，以生物量（g/L）為指標(biāo)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方［19］。見(jiàn)表3、表4。

表3 黃精雞腿菇發(fā)酵工藝因素水平

表4 黃精雞腿菇發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 菌絲體得率

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，黃精發(fā)酵后與普通發(fā)酵后生物量比較見(jiàn)圖1。 黃精均可使用3 種菌種進(jìn)行液體發(fā)酵且發(fā)酵后菌絲體的得率均顯著增加，黃精雞腿菇液體發(fā)酵后生物量最多，為8.47 g/L，與自身普通發(fā)酵比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 黃精蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵后生物量增加的最多，發(fā)酵后生物量為7.56 g/L，與自身普通發(fā)酵比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 黃精發(fā)酵后菌絲體的得率

3.2 菌種的優(yōu)選

由表2 可知，黃精和不同菌種液體發(fā)酵后，發(fā)酵后的產(chǎn)物DPPH 清除力比黃精水提液均有顯著增加。其中以秀珍菇發(fā)酵后DPPH 清除率最高，各發(fā)酵組與黃精水提液組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在羥自由基清除試驗(yàn)中，黃精經(jīng)過(guò)蛹蟲(chóng)草和秀珍菇發(fā)酵后，羥自由基抑制能力反而有顯著降低，黃精雞腿菇發(fā)酵后略有上升，可達(dá)到（78.12±9.02）U/mL。在總抗氧化能力方面，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，黃精雞腿菇發(fā)酵比黃精水提液顯著增強(qiáng)，兩組療效比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

綜合考慮，選擇雞腿菇對(duì)黃精進(jìn)行液體發(fā)酵，并對(duì)其液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

3.3 黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

3.3.1 黃精發(fā)酵濃度

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2-A，黃精在發(fā)酵質(zhì)量濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 時(shí)，生物量比普通發(fā)酵顯著性增加，10 mg/mL 時(shí)生物量最多。 因此，并不是黃精濃度越大提供的營(yíng)養(yǎng)越多，真菌生長(zhǎng)最好。

圖2 培養(yǎng)基條件單因素考察

3.3.2 碳源的種類(lèi)和濃度

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2-B。果糖和乳糖作為碳源時(shí)，其生物量比其他碳源的顯著減少，生物量最大的碳源是葡萄糖，因此選擇葡萄糖作為黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2-C。當(dāng)葡萄糖含量太高時(shí)，其生物量反而顯著減少；當(dāng)葡萄糖含量為0%和2%時(shí)，其生物量相差不大；0%的葡萄糖含量時(shí)，黃精發(fā)酵生物量反而高。

3.3.3 氮源種類(lèi)和濃度

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2-D，麩皮作為氮源時(shí)，生物量最多，酵母膏、硫酸銨和酪蛋白胨作為氮源時(shí)生物量顯著減少，因此麩皮更適合應(yīng)用在黃精液體發(fā)酵中。

以生物量（g/L）為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2-E，與不加麩皮比較，其他含量時(shí)的黃精發(fā)酵生物量均顯著增加，麩皮5%的含量時(shí)生物量最多，濃度增大時(shí)生物量趨于平緩。

結(jié)果如表4 所示，各因素對(duì)黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)影響的順序?yàn)椋狐S精濃度＞氮源含量＞碳源含量。由表5 方差分析數(shù)據(jù)可知，氮源和黃精濃度對(duì)黃精雞腿菇發(fā)酵具有顯著影響，而碳源的含量則對(duì)其雙向液體發(fā)酵工藝無(wú)顯著影響。 由分析結(jié)果可知，最佳培養(yǎng)基為葡萄糖0%，麩皮含量為5%，黃精質(zhì)量濃度為10 mg/mL，土豆20%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，按照該條件進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌絲體得率為（8.06±0.20）g/L。

表5 黃精雞腿菇發(fā)酵不同工藝因素水平下方差分析結(jié)果

4 討論

黃精在用三個(gè)菌種進(jìn)行雙向液體發(fā)酵后，生物量均有顯著增加，以雞腿菇為菌種進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，菌絲體得率最高。 此外，雞腿菇-黃精液體發(fā)酵后DPPH清除率和總抗氧化能力較其他菌種發(fā)酵后高，且羥自由基抑制能力也略有提高。 因此綜合考慮選擇雞腿菇作為對(duì)黃精進(jìn)行液體發(fā)酵的菌種。

真菌的生長(zhǎng)繁殖離不開(kāi)適宜的生長(zhǎng)條件，在合適的生長(zhǎng)條件下，真菌的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)才能正常進(jìn)行［20］。 各種營(yíng)養(yǎng)是微生物生長(zhǎng)的先決條件，并且各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只有在適宜的濃度時(shí)才能對(duì)真菌的生長(zhǎng)繁殖起到最佳效果。 所以培養(yǎng)基的優(yōu)化需要在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最佳配比。 結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基為葡萄糖0%，麩皮含量5%，黃精質(zhì)量濃度10 mg/mL，土豆20%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%。 此外由單因素結(jié)果可知，當(dāng)黃精含量持續(xù)升高時(shí)，生物量反而降低，說(shuō)明并不是黃精含量越多發(fā)酵過(guò)程越好，黃精-雞腿菇雙向發(fā)酵應(yīng)在適宜的含量范圍內(nèi)進(jìn)行，超出一定的限度反而會(huì)阻礙發(fā)酵過(guò)程。

由正交試驗(yàn)結(jié)果猜測(cè)，黃精在液體發(fā)酵過(guò)程中，其水提液為雞腿菇的生長(zhǎng)繁殖提供了一定的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是碳源所具備的營(yíng)養(yǎng)，此過(guò)程符合中藥雙向液體發(fā)酵的定義。 此外，黃精和雞腿菇中的主要成分為多糖類(lèi)物質(zhì)，相關(guān)研究表明黃精多糖和雞腿菇多糖具有很好的抗氧化作用［21-22］。 在雞腿菇發(fā)酵黃精后抗氧化能力顯著提升，說(shuō)明發(fā)酵后的產(chǎn)物具有更好的抗氧化能力，原因可能是發(fā)酵后產(chǎn)生了具有良好抗氧化能力的多糖。 本研究為開(kāi)發(fā)黃精發(fā)酵產(chǎn)品提供了新思路，為接下來(lái)雞腿菇雙向發(fā)酵黃精在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定參考。但是對(duì)于雞腿菇發(fā)酵黃精后新產(chǎn)生的活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步的研究和探索，這也是日后研究工作的重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)容。